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502015088_新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒pcr為陽(yáng)性，但酶切沒(méi)有出現(xiàn)目的片段
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想請(qǐng)教一下各位蟲(chóng)友： 我把我需要的兩個(gè)基因連接到表達(dá)載體上（先連接的300bp大小的基因，測(cè)序正確后再連接的1885bp大小的基因），通過(guò)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落在進(jìn)行質(zhì)粒提取，后 進(jìn)行質(zhì)粒PCR為陽(yáng)性。而對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行酶切，卻沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶（1885kb）。這是什么原因呢？ pKSV7-p43-REC質(zhì)粒PCR.jpg 酶切 |
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l1012003
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
2樓2015-05-30 13:46:06
502015088_
新蟲(chóng) (初入文壇)
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蟲(chóng)友，你好！我說(shuō)一下我的具體實(shí)驗(yàn)步驟，你幫我看一下疑問(wèn)出現(xiàn)在哪里。 首先，我用EcoRI和BamHI酶切我的上游基因（300bp）和質(zhì)粒骨架（P），連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑單菌落進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性后在提質(zhì)粒(P1)進(jìn)行質(zhì)粒PCR，結(jié)果為陽(yáng)性，送出去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確。后再用BamHI和HindIII對(duì)質(zhì)粒(P1)和我的下游基因（1885bp)進(jìn)行酶切，連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑單菌落進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性后在提取質(zhì)粒（P3），質(zhì)粒PCR為陽(yáng)性（圖一）。后送出去測(cè)序說(shuō)測(cè)序沒(méi)有信號(hào)，測(cè)序用的是上游基因的上游引物和下游基因的下游引物。后對(duì)P3質(zhì)粒進(jìn)行酶切，沒(méi)有下游基因（1885bp片段）。 |
3樓2015-06-01 10:34:39
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