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Dearstar新蟲 (小有名氣)
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[求助]
ppic9k轉(zhuǎn)GS115篩選表達(dá)問題。 已有2人參與
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各位蟲友大家好，我現(xiàn)在在做一個(gè)很普通的實(shí)驗(yàn)，但是由于是第一次做畢赤酵母，所以找不出問題在哪里。求大家指導(dǎo)。 我把我的目的基因合成插入PPIC9K，（上海生工完成），測(cè)序報(bào)告目的序列正確，后期我自己又測(cè)序前端表達(dá)起始位點(diǎn)均無誤，我將該質(zhì)粒經(jīng)過salI 酶切之后，電轉(zhuǎn)入GS115中，然后涂布的MD平板（四個(gè)平板共長120個(gè)左右），后來，我從MD平板上挑取生長的菌落到G418低濃度YPD上培養(yǎng)，再逐漸升到高濃度，一直到8mg/ml，最后仍有十幾個(gè)菌落，逐個(gè)挑取搖瓶發(fā)酵（按畢赤酵母操作手冊(cè)），沒有檢測(cè)到目的蛋白，然后取其中一個(gè)上20L發(fā)酵罐，檢測(cè)到了目的蛋白，但是其量只相當(dāng)于之前單克隆的量，甚至更低些。同時(shí)，我驗(yàn)證了我的MD,YPD,G418平板，均沒有問題。聽說對(duì)G418抗性有積累，另外我把對(duì)應(yīng)高濃度平板上的菌直接從MD轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD平板上再挑取到8mg/ml也生長。 現(xiàn)在的問題的：如果是一個(gè)克隆的話，為什么可以8mg/mlG418上生長？如果是因?yàn)楸磉_(dá)不好，克隆數(shù)和表達(dá)數(shù)不相對(duì)應(yīng)的情況的話，再從轉(zhuǎn)化開始那我這樣的篩選方法是不是也是得不到我要的高拷貝呢？求大家不吝賜教，非常感謝。 |
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 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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有幾個(gè)問題先問一下 1，你的片段插入在9K載體的位置？ 2，你的菌濃高嗎？ 3，你用MD平板篩出轉(zhuǎn)化子后其實(shí)可以挑幾個(gè)用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)看一下表達(dá)情況（將其作為初始菌，不同濃度G418篩得的多作為實(shí)驗(yàn)組） 4，另外，你也可以嘗試一下多次電轉(zhuǎn)篩選多拷貝 還有你的終極目標(biāo)是多拷貝的話，你也可以這樣做，洗脫后涂布，只要你G418梯度設(shè)置合理、寬泛，就一定能篩到最高拷貝的克隆，而挑單克隆畢竟不能將所有高拷貝轉(zhuǎn)化子一網(wǎng)打盡，這是挑單克隆的弊端，往往很可能你會(huì)錯(cuò)過那些最高拷貝的克隆。 如果實(shí)驗(yàn)都沒問題的話，表明你的表達(dá)量確實(shí)較低 |
3樓2015-09-21 11:40:23
gongsiyi
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5樓2018-05-18 16:46:09
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