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[求助]
各位蟲友能幫忙分析下我提取的果實(shí)RNA問題可能出在哪嗎？ 已有9人參與
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操作步驟 1) 取 800ul 提取緩沖液加入 2ml 離心管中，預(yù)熱至 65℃ 2) 取新鮮樣品放入研缽，在液氮中迅速研磨成粉末狀。 3) 迅速將 50-100mg 粉末狀樣品轉(zhuǎn)入預(yù)熱的提取緩沖液中， 渦旋振蕩器混勻，65℃水浴 10min，每隔 2min 混勻一次。 4) 水浴結(jié)束后， 冷卻至室溫。 5) 向離心管中加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)， 渦旋振蕩器充分混勻，冰浴10min。 6) 離心管在 4℃下 12000×g 離心 10min。 7) 取上清，轉(zhuǎn)入新的 2ml 離心管，重復(fù)操作(5)、 (6)。注：如果中間層仍有物質(zhì)，可以繼續(xù)重復(fù)步驟（ 5）和（ 6），直至中間層較干凈為止（但最多抽提 4 次，過柱時(shí)抽提 3 次，否組次數(shù)太多會(huì)降解）。 8) 取上清，轉(zhuǎn)入新的 1.5ml 離心管中， 加入 1/3 體積的 8M LiCl，混勻，加入等體積的異丙醇，混勻， 放入-20℃冰箱1小時(shí)。 9) 4℃， 12000×g 離心 15 min。棄掉上清，注意不要倒出沉淀。 10) 向 RNA 沉淀中加入 1ml 75％乙醇， 漩渦振蕩器上振蕩混勻 5s， 4oC， 7500×g離心 5min，棄上清。 11) 4oC， 7500×g 離心 1min，用槍頭小心吸棄多余液體。 提取了很多次，效果都不好！懇請(qǐng)各位幫忙分析一下！圖中間是mark，右邊是實(shí)驗(yàn)提取的RNA。是不是RNA降解的太厲害？還是DNA降解所出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象？ IMG_2443.JPG |
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銅蟲 (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小茶91520: 金幣+10, ★★★很有幫助 2015-06-17 16:36:38
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小茶91520: 金幣+10, ★★★很有幫助 2015-06-17 16:36:38
| 從圖上看RNA明顯降解了。不知道你的試劑是什么配方，植物中富含多酚和多糖，果實(shí)中多糖含量很高，用常用試劑通常效果不好，現(xiàn)在有很多文獻(xiàn)，里面是一些改良方法，比如加入PVP除酚類物質(zhì)，巰基乙醇防止氧化，licl是可以除多糖的，但是它在沉淀RNA的時(shí)候是選擇性沉淀分子量大的RNA，一些低分子量的可能會(huì)丟失，你如果做小RNA，或tRNA類的研究最好不用此方法，可以用終濃度10%的乙醇離心去除多糖。多查查文獻(xiàn)吧，我們提這一類的植物RNA都是自己配制的試劑，比試劑盒好一些。 |
14樓2015-06-17 15:39:15
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Neo2000
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