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蛋白質(zhì)純化問題 已有3人參與
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現(xiàn)在目前遇到的問題： 1，超濾過程中蛋白質(zhì)的去除率能夠達(dá)到多少，有篇文獻(xiàn)上，題名“Simplified purification of equine chorionic gonadotropin (eCG) – an example of the use of magnetic microsorbents for the isolation of glycoproteins from serum”表2中，達(dá)到了98% 2.不知道這種酸性蛋白能不能用陽離子交換樹脂進(jìn)行純化，可是真的有發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)比我的蛋白等電點(diǎn)p低的ecg用了陽離子交換樹脂，“題名”Extraction of Equine Chorionic Gonadotrophin from Pregnant Mare Plasma by Direct Adsorption on Chromatographic Media“。 3，離子交換介質(zhì)的上樣緩沖液，假如是乙酸鈉緩沖液，那洗脫的時(shí)候能否使磷酸鹽緩沖液。 4，由于活性的測(cè)定過程比較麻煩，費(fèi)錢費(fèi)力，所以不能更多的嘗試方法。 |
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2樓2015-06-16 20:59:23
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3樓2015-06-16 21:29:17
冼亮淀粉酶
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
bao可雅: 金幣+5 2015-07-06 09:49:25
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bao可雅: 金幣+5 2015-07-06 09:49:25
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一步法就能夠純化蛋白質(zhì)是很難的，除非親和層析。對(duì)于你的蛋白質(zhì)到底能達(dá)到什么效果，還得自己來做才知道。我遇到最極端的情況就是，文獻(xiàn)上達(dá)到一步純化，但自己完全做不出來。 等電點(diǎn)在酸性的蛋白質(zhì)如果用陰離子交換柱層析應(yīng)該是都能吸附上的，至于是不是用陽離子交換，只要是要看這個(gè)蛋白質(zhì)的pH穩(wěn)定范圍。 洗脫的時(shí)候我的習(xí)慣用法是用同樣的緩沖液。 |
4樓2015-06-16 21:53:07
5樓2015-06-16 22:17:26
6樓2015-06-16 22:19:58
冼亮淀粉酶
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7樓2015-06-16 23:39:33
惡魔的左眼
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8樓2015-06-18 10:33:18
calorimetry
銅蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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bao可雅: 金幣+20 2015-07-06 09:49:36
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bao可雅: 金幣+20 2015-07-06 09:49:36
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我說一次選擇離子交換柱的一般原則。 在考慮離子交換劑（離子交換功能基團(tuán)）的強(qiáng)弱時(shí)，如果目的蛋白質(zhì)很穩(wěn)定，應(yīng)首先選用強(qiáng)交換介質(zhì)，強(qiáng)交換介質(zhì)的動(dòng)力載量不會(huì)隨pH值的不同而改變，離子交換過程遵循最基本的吸附原理。所謂的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，一般可從其耐受的酸堿性、離子強(qiáng)度、溫度范圍這幾個(gè)角度考慮，考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定的極限是防止蛋白質(zhì)變性，而不是發(fā)生蛋白質(zhì)共價(jià)修飾，甚至降解。用各種層析柱分離提純蛋白質(zhì)時(shí)，一般不是常溫，就是低溫，所以通常不必考慮溫度對(duì)于需要層析的目的蛋白質(zhì)的影響，但是蛋白質(zhì)的酸堿性和離子強(qiáng)度的耐受性則必須要考慮。這點(diǎn)是很多蛋白質(zhì)分離提純的新手所容易忽略的。 使用強(qiáng)離子交換介質(zhì)允許較大的吸附pH及離子交換強(qiáng)度選擇范圍，目的分子吸附后只需要提高緩沖的鹽濃度即可洗脫，同時(shí)可有目的分子的濃縮效應(yīng)。而若離子交換介質(zhì)pH適用范圍較小，在pH小于6時(shí)，弱陽離子交換介質(zhì)失去電荷，而在pH大于9時(shí)，弱陰離子交換介質(zhì)失去電荷。所以，一般情況下，在分離等電點(diǎn)pH 6-9的目的蛋白質(zhì)，尤其是當(dāng)目的蛋白質(zhì)分子不穩(wěn)定時(shí)，需要較溫和的色譜條件才會(huì)選用弱交換介質(zhì)。對(duì)于未知的蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換層析柱分離提純時(shí)，也建議首先使用弱交換介質(zhì)。 樓主的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在2.2，如果選擇陽離子交換層析，你的緩沖溶液的pH必須要低于2.2，保證你的目的蛋白質(zhì)能夠帶上正電荷，進(jìn)而能夠掛在陽離子交換層析柱上。真的有沒有緩沖溶液到了這樣的pH還有緩沖容量？我是沒有聽說過，可能以后會(huì)有吧。 當(dāng)然，利用陰離子交換層析柱就很方便了，只要你的緩沖溶液的pH高于于2.2，保證你的目的蛋白質(zhì)能夠帶上負(fù)電荷，進(jìn)而能夠掛在陰離子交換層析柱上就行。這樣的緩沖液很容找到。 超濾一般只能夠用于去除無機(jī)和有機(jī)小分子，這些小分子至少與一般的常見蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量相差2個(gè)數(shù)量以上，這是超濾離心管的濾膜的孔徑?jīng)Q定的，由于一個(gè)超離心管就只有一層膜一種濾過孔徑，所以凡是不能穿過的蛋白質(zhì)都留下了，所以超濾離心管根本不可能用于分離純化不同的蛋白質(zhì)！跟不要說什么分離效率了。超濾離心管是除去小分子物質(zhì)的. |
9樓2015-06-18 14:00:10
calorimetry
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10樓2015-06-18 14:05:21
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