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[求助] 請(qǐng)問(wèn)為什么測(cè)序?qū)α说闹亟M質(zhì)粒，雙酶能切出其他條帶已有4人參與

做表達(dá)做了快一年了一直沒(méi)有表達(dá)出來(lái)，心里快急死了···

是一個(gè)pet30與目的基因的重組質(zhì)粒，目的基因117bp，總共只有11kDa大小的氨基酸，嘗試了多次誘導(dǎo)表達(dá)都不成功

測(cè)序沒(méi)有問(wèn)題（只測(cè)了T7啟動(dòng)子后的序列，加上插入的目的基因序列，跟給出的pet30序列圖是完全相同的，翻譯成氨基酸理論上也可以正常表達(dá)）

目前在找問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)酶切這個(gè)地方一直有問(wèn)題沒(méi)有解決

這個(gè)是提取的質(zhì)粒的照片
之后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入其他BL21和DH5a，測(cè)序也都正確；

請(qǐng)問(wèn)為什么測(cè)序?qū)α说闹亟M質(zhì)粒，雙酶能切出其他條帶-1

這個(gè)是將此質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切的電泳照片
請(qǐng)問(wèn)為什么在1000多和3000多的地方也有條帶呢？
按理說(shuō)商業(yè)質(zhì)粒不應(yīng)該會(huì)有其他部位能切開(kāi)的吧？請(qǐng)問(wèn)這是什么原因呢？

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1樓 2015-12-25 10:30:24

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liuxinyueer

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

1.商業(yè)質(zhì)粒查看質(zhì)粒圖譜、序列，EcoRI和XhoI切后明顯有多條條帶。
2.異源表達(dá)建議用偏好密碼子
3.查看T7啟動(dòng)子是否在目的細(xì)胞中屬于強(qiáng)啟動(dòng)子

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歡迎討論，小木蟲(chóng)未能及時(shí)回復(fù)，請(qǐng)郵箱: lmzhang1994@gmail.com

2樓2015-12-26 20:32:25

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科學(xué)小覃

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

從提取的質(zhì)�？促|(zhì)量不是很好，存在很多開(kāi)環(huán)或線性質(zhì)粒，試想一下線性質(zhì)粒被單酶切有沒(méi)有出現(xiàn)上述情況呢？

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生物科學(xué)

3樓2015-12-26 20:47:55

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siriusxuan

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你知道星號(hào)活性么，消化了多久？用的哪家的酶。

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4樓2015-12-27 11:36:40

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yoxue

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【答案】應(yīng)助回帖

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質(zhì)粒雙酶切的目的片段太小，因此質(zhì)量就低，在電泳后帶淺或看不清（或看不到）是很正常的

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5樓2015-12-27 13:31:34

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sdjnyxn123

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4樓: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-27 11:36:40
你知道星號(hào)活性么，消化了多久？用的哪家的酶。

是takara的，消化了6小時(shí)左右

星號(hào)活性了解過(guò)，但是不太清楚是哪里不對(duì)，按理說(shuō)試劑盒里應(yīng)該不會(huì)有亂七八糟的東西吧···我去借其他實(shí)驗(yàn)室的做一下看看

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6樓2015-12-27 17:38:09

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siriusxuan

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6樓: Originally posted by sdjnyxn123 at 2015-12-27 17:38:09
是takara的，消化了6小時(shí)左右

星號(hào)活性了解過(guò)，但是不太清楚是哪里不對(duì)，按理說(shuō)試劑盒里應(yīng)該不會(huì)有亂七八糟的東西吧···我去借其他實(shí)驗(yàn)室的做一下看看...

6個(gè)小時(shí)有點(diǎn)太久了，但如果是takera快酶系列的應(yīng)該沒(méi)什么問(wèn)題，可以半個(gè)小時(shí)嘗試一下啊。

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7樓2015-12-27 20:30:19

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wanglixin90

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有可能是酶用的時(shí)間太長(zhǎng)了，可以換個(gè)新鮮的酶試試。我之前也遇到過(guò)類似的問(wèn)題，換了新酶之后就好了

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8樓2015-12-27 23:09:16

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lyc910217

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我前面也出現(xiàn)過(guò)這種情況，有可能像前面幾位蟲(chóng)友說(shuō)的一樣，你的質(zhì)粒在提取過(guò)程中存在問(wèn)題，而你在雙酶切時(shí)，酶的活性不好，所以出現(xiàn)這樣的問(wèn)題，你可以重提一次質(zhì)粒，重新買兩管酶試試，現(xiàn)在已經(jīng)有快速酶切的酶了，可以試試

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菜鳥(niǎo)，獸醫(yī)

9樓2015-12-28 08:42:38

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zht930528

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同樣的，我前兩周做的雙酶切可以切出來(lái)兩條帶，但之后雙酶切卻切出來(lái)三條帶（包含兩條目的帶，額外一條2000bp大小的帶，同樣的體系。也不知道什么原因，測(cè)序顯示結(jié)果正確，也就沒(méi)有過(guò)多去考慮這個(gè)現(xiàn)象。先留名看看還有沒(méi)有更好的答案。

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麻辣王子不愛(ài)做實(shí)驗(yàn)

10樓2015-12-28 11:14:53

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