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小李紙11銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
重組質粒轉化大腸桿菌后長出來的全部是載體自連的產物，怎么回事？ 已有1人參與
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| PCR擴增目的片段，然后純化，連T載體，再把重組的質粒和空載體質粒酶切，純化、連接，結果長出的克隆挑12個提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現條帶大小都一樣，而且PCR檢測都是空載體。。。怎么回事啊，酶切的很完全啊，就算有空載也不至于這么多吧！ |
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梅太奇阿拉干
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3樓2016-07-16 11:10:33
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【答案】應助回帖
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2016-07-16 07:55:11
xn8008: 金幣+1, 應助指數+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-07-16 09:26:49
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xn8008: 金幣+1, 應助指數+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-07-16 09:26:49
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空載體有相應抗性，肯定可以進入感受態(tài)細胞。繼續(xù)挑吧，我前幾天挑了幾十個，結果切出相應大小片段，測序卻不正確。慢慢挑 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2016-07-15 23:27:43
4樓2016-07-16 18:44:23
原海亮
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數 +1
小李紙11: 金幣+6, ★★★★★最佳答案, 謝謝大神~ 2016-07-17 11:58:03
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你的目的條帶是從pcr產物+T載體上面切下來的，然后膠回收的么，如果這樣的話，個人覺得片段通過這些的方式獲得是最理想的，酶切回收的目的條帶應該是酶切比較完全的。主要的問題是你的載體處理，你使用的空載作為出發(fā)載體，基本上對是否酶切完全是無法判斷的，你可以把載體量加大，做一次二次酶切，確保載體酶切完全，當然最方便的辦法，就像你處理目的條帶一樣，不要用空載出發(fā)，找一個實驗室這個載體已經連接目的基因的重組載體，上面當然是要有你需要的位點的，以它出發(fā)做酶切，回收載體片段，你可以通過是否有小片段切除，在電泳上來判斷酶切是否完全。最后連接前，把目的條帶和載體片段跑電泳看看濃度，確保你最后回收到了目的片段，如果肉眼能看到條帶，我個人習慣會盡可能的減少載體用量，另外你12個克隆的質粒拿出來做個雙酶切看看吧。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-07-17 10:39:53
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