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小李紙11銀蟲 (正式寫手)
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重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后長(zhǎng)出來(lái)的全部是載體自連的產(chǎn)物，怎么回事？ 已有1人參與
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| PCR擴(kuò)增目的片段，然后純化，連T載體，再把重組的質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒酶切，純化、連接，結(jié)果長(zhǎng)出的克隆挑12個(gè)提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)條帶大小都一樣，而且PCR檢測(cè)都是空載體。。。怎么回事啊，酶切的很完全啊，就算有空載也不至于這么多吧！ |
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選擇遠(yuǎn)方523
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4樓2016-07-16 18:44:23
y383514131
銀蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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xn8008: 金幣+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-07-16 09:26:49
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空載體有相應(yīng)抗性，肯定可以進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。繼續(xù)挑吧，我前幾天挑了幾十個(gè)，結(jié)果切出相應(yīng)大小片段，測(cè)序卻不正確。慢慢挑 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2016-07-15 23:27:43
梅太奇阿拉干
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3樓2016-07-16 11:10:33
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小李紙11: 金幣+6, ★★★★★最佳答案, 謝謝大神~ 2016-07-17 11:58:03
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你的目的條帶是從pcr產(chǎn)物+T載體上面切下來(lái)的，然后膠回收的么，如果這樣的話，個(gè)人覺(jué)得片段通過(guò)這些的方式獲得是最理想的，酶切回收的目的條帶應(yīng)該是酶切比較完全的。主要的問(wèn)題是你的載體處理，你使用的空載作為出發(fā)載體，基本上對(duì)是否酶切完全是無(wú)法判斷的，你可以把載體量加大，做一次二次酶切，確保載體酶切完全，當(dāng)然最方便的辦法，就像你處理目的條帶一樣，不要用空載出發(fā)，找一個(gè)實(shí)驗(yàn)室這個(gè)載體已經(jīng)連接目的基因的重組載體，上面當(dāng)然是要有你需要的位點(diǎn)的，以它出發(fā)做酶切，回收載體片段，你可以通過(guò)是否有小片段切除，在電泳上來(lái)判斷酶切是否完全。最后連接前，把目的條帶和載體片段跑電泳看看濃度，確保你最后回收到了目的片段，如果肉眼能看到條帶，我個(gè)人習(xí)慣會(huì)盡可能的減少載體用量，另外你12個(gè)克隆的質(zhì)粒拿出來(lái)做個(gè)雙酶切看看吧。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-07-17 10:39:53
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