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安靜的啊啊啊新蟲 (初入文壇)
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[交流]
PCR一直P不出產(chǎn)物，求各位大神一起幫我來(lái)找原因？ 已有6人參與
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1. 模板是pcDNA3FLAG3-clk，是從其他實(shí)驗(yàn)室借來(lái)的，沒有測(cè)序過，但師姐曾成功表達(dá)出蛋白。提質(zhì)粒后，跑膠檢測(cè)模板是是純的。 2. 引物設(shè)計(jì)后找好幾個(gè)師姐看過，沒有問題 3. 陽(yáng)性對(duì)照有條帶 4. 模板濃度165ug/ml, 引物濃度25uM 25ul體系：5 X HF 5 3' Primer 1 5' Primer 1 10 X dNTP 1 Template 0.5 DMSO 1 Fusion 0.5 ddH2O 14.5 5. 目的基因1455bp, 延長(zhǎng)時(shí)間1分30秒，循環(huán)30次[wmv][/wmv] 6. 附件圖片 從左至右分別是 PCR sample, PCR sample 2, postive control, marker, template sample1 和 sample2 反應(yīng)體系完全相同， 位于PCR 機(jī)子的位置不同 postive control 片段大小正確 請(qǐng)求各位大神幫著找找原因啊，做不出來(lái)已經(jīng)快要瘋掉了  user 2017-02-06 16hr 53min clk PCR.jpg |
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安靜的啊啊啊
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3樓2017-02-08 15:54:47
yanlijuan
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yanlijuan
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-02-08 21:26:33
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你去看你的用的酶的說(shuō)明書，上面有一個(gè)dna模版做pcr適宜的濃度范圍。從你的膠上看，dna濃度很大，而且有點(diǎn)降解了…你根據(jù)要求稀釋一下dna，再試試！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2017-02-08 17:16:06
sweetcoffei
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| 陽(yáng)性對(duì)照有明顯的帶，說(shuō)明整個(gè)反應(yīng)體系沒有問題，從圖中PCR結(jié)果可以看出較為明顯的模板帶，而沒有目的帶，可能原因?yàn)椋?。模板濃度過高，可能因?yàn)殡s質(zhì)等導(dǎo)致PCR效率降低，因此沒有目的帶；2。延伸時(shí)間是否可以加長(zhǎng)為3分鐘，可能由于反應(yīng)體系非最佳，1分鐘時(shí)間不足以形成目的帶。3。退火溫度可否適當(dāng)降低，因?yàn)楦鞣N原因，引物并沒有與模板完成退火，因此沒有目的帶 |
5樓2017-02-09 09:08:33
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