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安靜的啊啊啊新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
PCR一直P(pán)不出產(chǎn)物，求各位大神一起幫我來(lái)找原因？ 已有6人參與
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1. 模板是pcDNA3FLAG3-clk，是從其他實(shí)驗(yàn)室借來(lái)的，沒(méi)有測(cè)序過(guò)，但師姐曾成功表達(dá)出蛋白。提質(zhì)粒后，跑膠檢測(cè)模板是是純的。 2. 引物設(shè)計(jì)后找好幾個(gè)師姐看過(guò)，沒(méi)有問(wèn)題 3. 陽(yáng)性對(duì)照有條帶 4. 模板濃度165ug/ml, 引物濃度25uM 25ul體系：5 X HF 5 3' Primer 1 5' Primer 1 10 X dNTP 1 Template 0.5 DMSO 1 Fusion 0.5 ddH2O 14.5 5. 目的基因1455bp, 延長(zhǎng)時(shí)間1分30秒，循環(huán)30次[wmv][/wmv] 6. 附件圖片 從左至右分別是 PCR sample, PCR sample 2, postive control, marker, template sample1 和 sample2 反應(yīng)體系完全相同， 位于PCR 機(jī)子的位置不同 postive control 片段大小正確 請(qǐng)求各位大神幫著找找原因啊，做不出來(lái)已經(jīng)快要瘋掉了  user 2017-02-06 16hr 53min clk PCR.jpg |
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yanlijuan
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2樓2017-02-08 15:51:44
安靜的啊啊啊
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3樓2017-02-08 15:54:47
yanlijuan
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西門(mén)吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-02-08 21:26:33
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你去看你的用的酶的說(shuō)明書(shū)，上面有一個(gè)dna模版做pcr適宜的濃度范圍。從你的膠上看，dna濃度很大，而且有點(diǎn)降解了…你根據(jù)要求稀釋一下dna，再試試！ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
4樓2017-02-08 17:16:06
sweetcoffei
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| 陽(yáng)性對(duì)照有明顯的帶，說(shuō)明整個(gè)反應(yīng)體系沒(méi)有問(wèn)題，從圖中PCR結(jié)果可以看出較為明顯的模板帶，而沒(méi)有目的帶，可能原因?yàn)椋?。模板濃度過(guò)高，可能因?yàn)殡s質(zhì)等導(dǎo)致PCR效率降低，因此沒(méi)有目的帶；2。延伸時(shí)間是否可以加長(zhǎng)為3分鐘，可能由于反應(yīng)體系非最佳，1分鐘時(shí)間不足以形成目的帶。3。退火溫度可否適當(dāng)降低，因?yàn)楦鞣N原因，引物并沒(méi)有與模板完成退火，因此沒(méi)有目的帶 |
5樓2017-02-09 09:08:33
yang1200500819
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首先25ul體系模板10 ng足夠了，其次退火可以試試參考溫度上下三度以內(nèi)的其它溫度，再不行換gc buffer試試，最后一個(gè)小小建議，引物用五分之一足夠了 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
6樓2017-02-09 09:46:59
1551099196
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可以稀釋模板1000倍試試看，以前剛做的時(shí)候舍不得稀釋模板，跟這情況差不多 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
7樓2017-02-09 09:56:52
X小天T
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模板濃度降低到10ug加1ul（建議），引物濃度我們用的是10的，還有DMSO不加也試試，延長(zhǎng)時(shí)間提高到兩分鐘，說(shuō)明書(shū)說(shuō)的酶活力是每分鐘一千那是正常情況下，一般保守點(diǎn)適當(dāng)提高延長(zhǎng)時(shí)間 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
8樓2017-02-09 11:19:03
X小天T
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9樓2017-02-09 11:20:08
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| 我分析一下：首先如果你的陽(yáng)性對(duì)照和擴(kuò)增樣本用同一體系（包括模板濃度和引物），陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)出來(lái)，你的目標(biāo)樣本沒(méi)有擴(kuò)出來(lái)，說(shuō)明體系沒(méi)有問(wèn)題（包括退火、延伸、模板量、延伸時(shí)間等）那唯一出問(wèn)題的就在你的樣本上，再看擴(kuò)增條帶一片糊，要么就是沒(méi)有特異性，要么就是有其他物質(zhì)影響擴(kuò)增。不特異是不是你的樣本不對(duì)（給你的不是你要的或他們改造過(guò)），如果這個(gè)問(wèn)題排除，可能你抽提質(zhì)粒的過(guò)程中有問(wèn)題，重新抽提質(zhì)粒，注意鹽離子和乙醇揮發(fā)。我自己的一點(diǎn)判斷，如果不對(duì)勿噴。 |
10樓2017-02-10 11:37:05
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