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安靜的啊啊啊新蟲 (初入文壇)
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[交流]
PCR一直P不出產(chǎn)物，求各位大神一起幫我來找原因？ 已有6人參與
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1. 模板是pcDNA3FLAG3-clk，是從其他實驗室借來的，沒有測序過，但師姐曾成功表達(dá)出蛋白。提質(zhì)粒后，跑膠檢測模板是是純的。 2. 引物設(shè)計后找好幾個師姐看過，沒有問題 3. 陽性對照有條帶 4. 模板濃度165ug/ml, 引物濃度25uM 25ul體系：5 X HF 5 3' Primer 1 5' Primer 1 10 X dNTP 1 Template 0.5 DMSO 1 Fusion 0.5 ddH2O 14.5 5. 目的基因1455bp, 延長時間1分30秒，循環(huán)30次[wmv][/wmv] 6. 附件圖片 從左至右分別是 PCR sample, PCR sample 2, postive control, marker, template sample1 和 sample2 反應(yīng)體系完全相同， 位于PCR 機子的位置不同 postive control 片段大小正確 請求各位大神幫著找找原因啊，做不出來已經(jīng)快要瘋掉了  user 2017-02-06 16hr 53min clk PCR.jpg |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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| 我分析一下：首先如果你的陽性對照和擴(kuò)增樣本用同一體系（包括模板濃度和引物），陽性對照擴(kuò)出來，你的目標(biāo)樣本沒有擴(kuò)出來，說明體系沒有問題（包括退火、延伸、模板量、延伸時間等）那唯一出問題的就在你的樣本上，再看擴(kuò)增條帶一片糊，要么就是沒有特異性，要么就是有其他物質(zhì)影響擴(kuò)增。不特異是不是你的樣本不對（給你的不是你要的或他們改造過），如果這個問題排除，可能你抽提質(zhì)粒的過程中有問題，重新抽提質(zhì)粒，注意鹽離子和乙醇揮發(fā)。我自己的一點判斷，如果不對勿噴。 |
10樓2017-02-10 11:37:05
yanlijuan
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2樓2017-02-08 15:51:44
安靜的啊啊啊
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3樓2017-02-08 15:54:47
yanlijuan
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-02-08 21:26:33
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-02-08 21:26:33
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你去看你的用的酶的說明書，上面有一個dna模版做pcr適宜的濃度范圍。從你的膠上看，dna濃度很大，而且有點降解了…你根據(jù)要求稀釋一下dna，再試試！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2017-02-08 17:16:06
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