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安靜的啊啊啊新蟲 (初入文壇)
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[交流]
PCR一直P不出產(chǎn)物，求各位大神一起幫我來找原因？ 已有6人參與
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1. 模板是pcDNA3FLAG3-clk，是從其他實驗室借來的，沒有測序過，但師姐曾成功表達出蛋白。提質(zhì)粒后，跑膠檢測模板是是純的。 2. 引物設(shè)計后找好幾個師姐看過，沒有問題 3. 陽性對照有條帶 4. 模板濃度165ug/ml, 引物濃度25uM 25ul體系：5 X HF 5 3' Primer 1 5' Primer 1 10 X dNTP 1 Template 0.5 DMSO 1 Fusion 0.5 ddH2O 14.5 5. 目的基因1455bp, 延長時間1分30秒，循環(huán)30次[wmv][/wmv] 6. 附件圖片 從左至右分別是 PCR sample, PCR sample 2, postive control, marker, template sample1 和 sample2 反應(yīng)體系完全相同， 位于PCR 機子的位置不同 postive control 片段大小正確 請求各位大神幫著找找原因啊，做不出來已經(jīng)快要瘋掉了  user 2017-02-06 16hr 53min clk PCR.jpg |
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yanlijuan
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2樓2017-02-08 15:51:44
安靜的啊啊啊
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3樓2017-02-08 15:54:47
yanlijuan
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你去看你的用的酶的說明書，上面有一個dna模版做pcr適宜的濃度范圍。從你的膠上看，dna濃度很大，而且有點降解了…你根據(jù)要求稀釋一下dna，再試試！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2017-02-08 17:16:06
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5樓2017-02-09 09:08:33
yang1200500819
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首先25ul體系模板10 ng足夠了，其次退火可以試試參考溫度上下三度以內(nèi)的其它溫度，再不行換gc buffer試試，最后一個小小建議，引物用五分之一足夠了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2017-02-09 09:46:59
1551099196
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模板濃度降低到10ug加1ul（建議），引物濃度我們用的是10的，還有DMSO不加也試試，延長時間提高到兩分鐘，說明書說的酶活力是每分鐘一千那是正常情況下，一般保守點適當提高延長時間 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2017-02-09 11:19:03
X小天T
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9樓2017-02-09 11:20:08
10樓2017-02-10 11:37:05
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