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zhiqiang5070木蟲 (正式寫手)
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膠回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后菌液PCR電泳條帶出現(xiàn)問題
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我的cDNA膠回收后條帶約1000kb強，之后連接到T載體上（將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體16℃連接過夜，膠回收DNA4.5微，T載體 0.5微，SolutionI 5微升），之后轉(zhuǎn)化到天根公司Ｅ.ｃｏｌｉ感受態(tài)細胞中，接菌，挑菌后搖菌。之后菌液ＰＣＲ（自己的引物和Ｍ１３引物分別跑了都差不多），可是電泳條帶發(fā)生改變，出現(xiàn)了２０００多ｋｂ的條帶。 各位學長學姐，請問這是怎么回事？好像出現(xiàn)了ｃＤＮＡ自己連接起來的現(xiàn)象。還有如何解決？本人小蟲，沒啥金幣，還望見諒。 |
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hellolin
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6樓2011-10-28 17:30:23
zhiqiang5070
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上面寫錯了，我的cDNA為1kb多點，不是1000kb，后面2kb多點，嘿嘿。2樓2011-06-10 14:52:13
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3樓2011-06-10 14:56:16
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【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(EPI+1): epi大神 2011-06-10 15:14:34
zhiqiang5070(金幣+3): 你很厲害啊，可能是沒連上，剩余的帶應(yīng)該是空載體和非特異性產(chǎn)物 2011-06-13 08:38:28
zhiqiang5070(金幣+3): 你很厲害啊，可能是沒連上，剩余的帶應(yīng)該是空載體和非特異性產(chǎn)物 2011-06-13 08:38:28
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著實感覺很奇怪，應(yīng)該是一條1KB的條帶。。。 考慮沒有連接上的情況，2kb很有可能是非特異性條帶； 建議： 1:重新進行連接，我看你的連接體系中DNA有點太多了，可以是載體的2-3倍（濃度，這個需要你跑膠定量的）； 2：將你現(xiàn)在疑似含有重組載體的菌劃至平板上，提取質(zhì)粒，先看看能不能提取出來，能的話再做一個酶切看看。。。 |
4樓2011-06-10 15:07:59
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