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小周鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
重疊延伸PCR引物合成求助
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最近想把兩個(gè)DNA片段連起來(lái)，想用SOE PCR的方法，看了半天引物設(shè)計(jì)時(shí)都沒(méi)有搞明白。 假設(shè)我的片段A序列為：5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CAC CAT3’ B片段的序列為：5’GACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’ 希望的結(jié)果為A在前B在后： 5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CACCATGACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’ 中間兩條引物該怎樣設(shè)計(jì)呢？謝謝 |
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小周
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3樓2012-03-24 14:57:01
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2樓2012-03-24 13:17:14
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4樓2012-03-24 15:14:51
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【答案】應(yīng)助回帖
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telomerase: 金幣+1, 謝謝你的熱心應(yīng)助 2012-03-24 20:36:38
小周: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-03-26 17:08:10
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就是搭橋PCR。設(shè)計(jì)引物時(shí)A片段3‘端取20bp左右的堿基，B片段5’端取20個(gè)堿基左右，總堿基不要超過(guò)50bp（大于50公司合成會(huì)比較貴），同時(shí)合成該引物反向互補(bǔ)片段。 用這條引物跟B片段的反向引物擴(kuò)增B片段。再用這條引物反向互補(bǔ)序列為反向引物與A片段的正向引物擴(kuò)增A片段。 把上一步擴(kuò)增的A，B產(chǎn)物等摩爾混合再用A片段的正向引物與B片段的反向引物擴(kuò)增，跑膠，回收你需要的大小的片段。 |
5樓2012-03-24 16:16:08
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