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小周

鐵桿木蟲 (著名寫手)

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[求助] 重疊延伸PCR引物合成求助

最近想把兩個(gè)DNA片段連起來(lái)，想用SOE PCR的方法，看了半天引物設(shè)計(jì)時(shí)都沒有搞明白。
假設(shè)我的片段A序列為：5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CAC CAT3’

B片段的序列為：5’GACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’

希望的結(jié)果為A在前B在后：
5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CACCATGACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’
中間兩條引物該怎樣設(shè)計(jì)呢？謝謝

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1樓 2012-03-24 12:26:05

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【答案】應(yīng)助回帖

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telomerase: 金幣+1, 謝謝你的熱心應(yīng)助 2012-03-24 20:36:38
小周: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-03-26 17:08:10

就是搭橋PCR。設(shè)計(jì)引物時(shí)A片段3‘端取20bp左右的堿基，B片段5’端取20個(gè)堿基左右，總堿基不要超過(guò)50bp（大于50公司合成會(huì)比較貴），同時(shí)合成該引物反向互補(bǔ)片段。
用這條引物跟B片段的反向引物擴(kuò)增B片段。再用這條引物反向互補(bǔ)序列為反向引物與A片段的正向引物擴(kuò)增A片段。
把上一步擴(kuò)增的A，B產(chǎn)物等摩爾混合再用A片段的正向引物與B片段的反向引物擴(kuò)增，跑膠，回收你需要的大小的片段。

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hehe

5樓2012-03-24 16:16:08

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tyw2623

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overlapPCR

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2012-03-25 21:18:04, 13.34 K

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小周

水遁

9樓2012-03-25 21:18:16

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顏英

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
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小周: 金幣+2, ★有幫助 2012-03-26 17:07:52

引物的設(shè)計(jì)不是有軟件嗎？我的實(shí)驗(yàn)也需要設(shè)計(jì)引物，師姐推薦我用primer premier5這個(gè)軟件，因?yàn)槲业哪康幕蜻€沒確定，所以這個(gè)軟件我還沒用過(guò)，不知好不好用呵呵。。。

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2樓2012-03-24 13:17:14

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 顏英 at 2012-03-24 13:17:14:
引物的設(shè)計(jì)不是有軟件嗎？我的實(shí)驗(yàn)也需要設(shè)計(jì)引物，師姐推薦我用primer premier5這個(gè)軟件，因?yàn)槲业哪康幕蜻€沒確定，所以這個(gè)軟件我還沒用過(guò)，不知好不好用呵呵。。。

這個(gè)我知道，呵呵。連接片段稍微麻煩點(diǎn)。

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3樓2012-03-24 14:57:01

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imyting

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小周: 金幣+3, ★有幫助, 網(wǎng)上的例子也看了，我大概也知道應(yīng)該是樣子，腦子有點(diǎn)笨，具體怎么設(shè)計(jì)想不明白。 2012-03-24 15:40:45

取A序列的末端20個(gè)和B序列的前端20個(gè)，分別與A和B進(jìn)行PCR，再回收產(chǎn)物做模板進(jìn)行第二次PCR。我只是舉個(gè)例子，具體的引物你還得仔細(xì)分析一下。

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悠哉游哉做實(shí)驗(yàn)，成兮敗兮我隨便

4樓2012-03-24 15:14:51

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jinpeng_6118

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【答案】應(yīng)助回帖

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小周: 金幣+5, ★有幫助 2012-03-26 17:08:23

就是說(shuō)A片段的下游與B片段的上游交接處重疊30-40個(gè)堿基就行了。A片段的下游引物稍微再往B方向延伸一些，而B片段的上游引物往A方向延伸些，他們就能重復(fù)出一段重疊區(qū)域。

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人生百態(tài)原為海，看破紅塵方為岸！

6樓2012-03-25 10:27:06

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小周: 金幣+5, ★有幫助 2012-03-26 17:08:32

1.設(shè)計(jì)2對(duì)引物，A5‘ &3’ ；B5‘&3’；A3‘和B5’ 引物有大于15bp的overlap。
2. 分別擴(kuò)增A和B；
3.A和BPCR 產(chǎn)物等摩爾比混合，共同做模板，用A5‘和B3’擴(kuò)增。
4.如果擴(kuò)增效果不好，可以將A5‘和B3’ 向中間移動(dòng)20左右bp重新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增。

可以查看Overlap extension PCR

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生活是面鏡子~

7樓2012-03-25 14:58:23

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

有需要的話可以把具體序列發(fā)過(guò)來(lái)，給你設(shè)計(jì) 了試試哦

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小周

8樓2012-03-25 19:22:06

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引用回帖:

8樓: Originally posted by 生物一點(diǎn)點(diǎn) at 2012-03-25 19:22:06:
有需要的話可以把具體序列發(fā)過(guò)來(lái)，給你設(shè)計(jì) 了試試哦

謝謝啦

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10樓2012-03-26 17:11:15

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