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小周鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
重疊延伸PCR引物合成求助
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最近想把兩個(gè)DNA片段連起來(lái)，想用SOE PCR的方法，看了半天引物設(shè)計(jì)時(shí)都沒(méi)有搞明白。 假設(shè)我的片段A序列為：5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CAC CAT3’ B片段的序列為：5’GACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’ 希望的結(jié)果為A在前B在后： 5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CACCATGACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’ 中間兩條引物該怎樣設(shè)計(jì)呢？謝謝 |
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lvbobo823
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就是搭橋PCR。設(shè)計(jì)引物時(shí)A片段3‘端取20bp左右的堿基，B片段5’端取20個(gè)堿基左右，總堿基不要超過(guò)50bp（大于50公司合成會(huì)比較貴），同時(shí)合成該引物反向互補(bǔ)片段。 用這條引物跟B片段的反向引物擴(kuò)增B片段。再用這條引物反向互補(bǔ)序列為反向引物與A片段的正向引物擴(kuò)增A片段。 把上一步擴(kuò)增的A，B產(chǎn)物等摩爾混合再用A片段的正向引物與B片段的反向引物擴(kuò)增，跑膠，回收你需要的大小的片段。 |
5樓2012-03-24 16:16:08
| overlapPCR |
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2012-03-25 21:18:04, 13.34 K
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小周9樓2012-03-25 21:18:16
顏英
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4樓2012-03-24 15:14:51
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【答案】應(yīng)助回帖
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小周: 金幣+5, ★有幫助 2012-03-26 17:08:32
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1.設(shè)計(jì)2對(duì)引物，A5‘ &3’ ；B5‘&3’；A3‘和B5’ 引物有大于15bp的overlap。 2. 分別擴(kuò)增A和B； 3.A和BPCR 產(chǎn)物等摩爾比混合，共同做模板，用A5‘和B3’擴(kuò)增。 4.如果擴(kuò)增效果不好，可以將A5‘和B3’ 向中間移動(dòng)20左右bp重新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增。 可以查看Overlap extension PCR |
7樓2012-03-25 14:58:23
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