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麥堂straw銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
畢赤酵母表達培養(yǎng)基 已有1人參與
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| 畢赤酵母GS115對克隆進行表達過程中，一般使用的為BMGY/BMMY甲醇誘導培養(yǎng)，請教一下各位大俠，能否有更為簡便的培養(yǎng)基，可以省略將BMGY換為BMMY的中間步驟，一步法達到表達效果（表達的為一種酶，因需進行大批量接種表達，對表達量要求不高只求簡便易行）？ |
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麥堂straw
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送紅花一朵 |
感謝回復。 我是建立了一個畢赤酵母轉(zhuǎn)化子庫（>10000個），從大量轉(zhuǎn)化子中篩選目的轉(zhuǎn)化子。克隆載體是已經(jīng)構(gòu)建好了的，為AOX啟動子甲醇誘導表達，換啟動子基本上沒有可能�，F(xiàn)只想尋求一高效簡便的表達方法，因需對轉(zhuǎn)化子庫中每個轉(zhuǎn)化子進行誘導表達確定表達產(chǎn)物是否有特異性狀，所以利用發(fā)酵罐也不可能。想利用96孔板對每個轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)，之后篩選，但因BMGY/BMMY培養(yǎng)基過程中，需要離心去除BMGY后再加BMMY，對于大量篩選仍是顯得十分不便。想請教的是，轉(zhuǎn)化子在BMGY中培養(yǎng)一天后，如果不去除直接加甲醇誘導表達是否會影響很大，因BMMY與BMGY差別只在于一個是甲醇，一個是甘油。 因之前一直做的是分子生物載體構(gòu)建之類工作，對酵母表達這塊還是不太熟悉，望大俠不吝賜教，十分感謝！ |
3樓2013-07-03 21:24:31
reallpf
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
麥堂straw(amisking代發(fā)): 金幣+3, 回答的非常不錯。 2013-07-03 23:04:47
感謝參與，應助指數(shù) +1
麥堂straw(amisking代發(fā)): 金幣+3, 回答的非常不錯。 2013-07-03 23:04:47
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那你可以從兩個角度來考慮： 1.換成組成型表達，比如pGAP啟動子，畢赤酵母使用組成型表達啟動子，對于有些酶可能比誘導型表達量還高。而且組成型表達的重組菌株，為了簡單而且不考慮表達量的話，將是首選，可以直接利用YPD發(fā)酵3天左右即可。 2.如果必須用誘導型的啟動子，而不想換培養(yǎng)基，那么只能利用發(fā)酵罐了。但是畢赤酵母在發(fā)酵罐上進行甲醇誘導表達，發(fā)酵周期比較長，約1周（初期生長半天，增殖約1天，甘油補料約1天，甲醇誘導約4天）。但是與搖瓶發(fā)酵相比，時間上沒有太大差別。但是在發(fā)酵罐上進行畢赤酵母的甲醇誘導表達，需要嚴格調(diào)控甘油補料和甲醇誘導時間點，所以大概要守夜1~2晚。 因此，如果不考慮表達量，只為了簡單，建議你選擇組成型表達。市場上已經(jīng)有非常成熟的pGAPZmazF系列載體，可以根據(jù)自己的實驗情況選擇。 |
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2樓2013-07-03 18:57:16
reallpf
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【答案】應助回帖
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如果按照你說的，認為如果你直接添加甲醇需要做到兩點： 1.甘油（即碳源）必須完全耗完，并且饑餓2小時以上，方能誘導成功。 2.搖瓶階段之所以換培養(yǎng)基，主要還是最初的培養(yǎng)基的碳源與氮源比例問題，因此在后期補加甲醇的過程中，考慮加入一定量的氮源來補充氮源并平衡碳氮比。 針對你說的問題，想說的有2點： 1.換啟動子還是比較簡單，但需要你實驗室有相關的實驗基礎，即將PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化畢赤酵母，相關的文章你可以搜索“PCR依賴型方法構(gòu)建高質(zhì)量酵母基因突變文庫”一文，然后結(jié)合你自己的實際情況來做。 2.如果你使用96孔板培養(yǎng)，那么換培養(yǎng)基也非常容易操作。現(xiàn)在有離心機可以直接離心96孔板，然后更換培養(yǎng)基，這個方法更加容易。 |
4樓2013-07-04 19:07:09
5樓2015-09-16 19:15:51
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