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子瀟楊帆金蟲 (初入文壇)
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[求助]
誠心求教各位前輩：篩選擴(kuò)增體系時的PCR圖片，這是怎么回事啊？
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緊急求教各位前輩： 剛開始做SCoT分子標(biāo)記對玫瑰的最優(yōu)擴(kuò)增體系的篩選，剛剛開始跑PCR（普通的），結(jié)果結(jié)果成了這樣，彌散的好厲害，尤其是第二次跑的這次，連marker都看不清楚，像重影似的，請教各位前輩能否給以指點，誠心求教出現(xiàn)這種情況的原因是什么，我該怎么解決��？？？ 我的擴(kuò)增程序設(shè)定的為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，50℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共 36 個循環(huán)；72℃最后延伸 10 min。  11-7（篩）_副本.jpg 11-7（篩2）_副本.jpg |
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2樓2013-11-08 11:01:21
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子瀟楊帆: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-11-09 10:10:12
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樓主的PCR擴(kuò)增出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 PCR擴(kuò)增時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因與對策 2013年8月23日總結(jié)（第二次修訂，加上序號，使文章的層次清晰，另外修正了錯漏之處） 2013年10月9日凌晨第三次修改補(bǔ)充。 PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差或酶的專一性不夠，DNA模板量過大，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多，模板長于3kd所引起。 其對策有： 1.減少酶量（一般以2單位Taq DNA聚合酶為基點，分梯度上下調(diào)一調(diào)，其他酶也差不多如此濃度，可以參考說明書）；加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性或調(diào)換另一來源的專一性更好的DNA聚合酶。 2. 增加DNA聚合酶的專一性。 （1）改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油，若此操作引起酶的濃度過高，可以適當(dāng)加雙蒸餾水稀釋。 （3）為了加強(qiáng)Taq DNA聚合酶的專一性。 的專一性，可在反應(yīng)體系中加入：1-1.5mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以增加Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定性。 3.適當(dāng)減少dNTP的濃度；減少dNTP的濃度一般需要與降低Mg2+濃度同方向偶聯(lián)進(jìn)行，但是不必按同樣的比例。 4.適當(dāng)降低Mg2+濃 度，可以采用梯度遞減方式，以每次0.5mol/L遞減，但是Mg2+的終濃度不要低于1.0mol/L。 5. 縮短PCR反應(yīng)的退火溫度時間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計引物之前，不要大范圍地變動反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度提高1-3度。 6.使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，非特異性擴(kuò)增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 7.采用使用專一性更強(qiáng)的梯度降低PCR、熱啟動PCR和巢式PCR。使用熱啟動模式。使用熱啟動時可以購買商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。巢式PCR也有現(xiàn)成的試劑盒可以購買。 8. 保證PCR反應(yīng)的DNA模板的質(zhì)量，要用電泳檢測一下分子量和純度，質(zhì)量不好則要重新提取和純化DNA模板；適當(dāng)增加DNA模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 9.以上措施都不行時，最后就只能重新設(shè)計引物，加強(qiáng)引物的專一性。 10.適當(dāng)減少DNA模板量。 11.適當(dāng)減少循環(huán)次數(shù)，一般也就循環(huán)25次就差不多了。 12.如果樓主的PCR模板是3kd或者更大，用普通PCR效果大概不會很理想，應(yīng)該考慮使用Long-Range PCR。 本回答是我剛剛做的修改和補(bǔ)充的此類問題的回答，并不是照抄我以前的同類問題的解答內(nèi)容。 |
6樓2013-11-09 02:44:55
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