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[求助] 求助，酶切之后，非但是沒(méi)有產(chǎn)物，而且連原本的質(zhì)粒也沒(méi)跑出來(lái) 已有1人參與

酶切之后，非但是沒(méi)有產(chǎn)物，而且連原本的質(zhì)粒也沒(méi)跑出來(lái)。我用得世PET32a質(zhì)粒做雙酶切，體系為10*buffer tango 10微升 BamhI 2微升 X—hol 2微升質(zhì)粒 36微升。之前提了4管32a質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳跑膠都有非常明顯的條帶，可是經(jīng)過(guò)37度6小時(shí)的雙酶切之后，再去跑膠發(fā)現(xiàn)32a質(zhì)粒也不見(jiàn)了。但是marker還是跑的很清晰，另外，我還同時(shí)做了PigC基因的雙酶切也是37度切了6個(gè)小時(shí)，但是卻跑出了比較暗的條帶，這是和32a雙酶切后質(zhì)粒一起跑的，好糾結(jié)，做了兩個(gè)月了，已經(jīng)出現(xiàn)好對(duì)此32a質(zhì)粒酶切之后就不見(jiàn)了，有時(shí)候經(jīng)過(guò)純化試劑盒純化之后也會(huì)沒(méi)有，郁悶了.....求各位大神指點(diǎn)，小子本科生，實(shí)在是經(jīng)驗(yàn)少。。。求指點(diǎn)，金幣也只有這么點(diǎn)，各位別嫌少啊

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1樓 2014-02-27 21:57:03

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能上個(gè)圖來(lái)看看么？沒(méi)了指的是泳道完全黑的，還是全部彌散？

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2樓2014-02-27 22:34:49

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2樓: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 22:34:49
能上個(gè)圖來(lái)看看么？沒(méi)了指的是泳道完全黑的，還是全部彌散？

是這樣的，學(xué)校儀器不怎么好使，當(dāng)時(shí)U盤(pán)插進(jìn)去也沒(méi)反應(yīng)，我精確描述給你，PigC在將近3000bp處有暗條帶，這個(gè)看起來(lái)還是很明顯的，因?yàn)橹車(chē)己馨�。�?2a質(zhì)粒則全部都是黑的。但是在膠的最盡頭卻是都有相當(dāng)一大片的模糊亮影，和上述PigC的條帶兩度是一致的。32a是5000bp以上的質(zhì)粒。

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3樓2014-02-27 22:51:27

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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-02-28 11:50:12

引用回帖:

3樓: Originally posted by 無(wú)敵小莫 at 2014-02-27 22:51:27
是這樣的，學(xué)校儀器不怎么好使，當(dāng)時(shí)U盤(pán)插進(jìn)去也沒(méi)反應(yīng)，我精確描述給你，PigC在將近3000bp處有暗條帶，這個(gè)看起來(lái)還是很明顯的，因?yàn)橹車(chē)己馨�。�?2a質(zhì)粒則全部都是黑的。但是在膠的最盡頭卻是都有相當(dāng)一大片的 ...

膠的盡頭指的是梳孔處還是跑的底部？要是底部的話(huà)，說(shuō)明全部切碎了。要不就是您的質(zhì)粒里存在大量的BamH I的位點(diǎn)，要不就是酶切反應(yīng)中有其它污染。如果是梳孔處，則說(shuō)明完全沒(méi)切開(kāi)，可能是質(zhì)粒提取的質(zhì)量不高，影響了酶切。

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4樓2014-02-27 23:02:06

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4樓: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 23:02:06
膠的盡頭指的是梳孔處還是跑的底部？要是底部的話(huà)，說(shuō)明全部切碎了。要不就是您的質(zhì)粒里存在大量的BamH I的位點(diǎn)，要不就是酶切反應(yīng)中有其它污染。如果是梳孔處，則說(shuō)明完全沒(méi)切開(kāi)，可能是質(zhì)粒提取的質(zhì)量不高，影響 ...

膠不是有打樣孔嗎，我說(shuō)的膠的盡頭指的不是打樣孔那一邊，這個(gè)東西已經(jīng)搞了兩個(gè)多月了，寒假之前也在搞，我的組員都不樂(lè)意做了，我也是沒(méi)辦法。。。

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5樓2014-02-27 23:06:54

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也許是污染了吧真糾結(jié) 馬上要考研了，這個(gè)構(gòu)建菌不知道還要多久

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6樓2014-02-27 23:09:46

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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-02-28 11:50:19

引用回帖:

5樓: Originally posted by 無(wú)敵小莫 at 2014-02-27 23:06:54
膠不是有打樣孔嗎，我說(shuō)的膠的盡頭指的不是打樣孔那一邊，這個(gè)東西已經(jīng)搞了兩個(gè)多月了，寒假之前也在搞，我的組員都不樂(lè)意做了，我也是沒(méi)辦法。。。...

告訴老板，買(mǎi)新酶，這個(gè)用不了多少錢(qián)。還有就是你提質(zhì)粒時(shí)候嚴(yán)格按照試劑盒來(lái)，洗干凈點(diǎn)，最后一步一定不要有乙醇?xì)埩�，而且不能吹得太干。加油�?

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7樓2014-02-27 23:14:37

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