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windleakey金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒構(gòu)建 連接轉(zhuǎn)化效率低 求幫助啊 已有1人參與
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我實(shí)驗(yàn)是這樣的： 目的基因已經(jīng)連進(jìn)了T載體，下面往表達(dá)載體（pet28a、pGEX-6p-1）里面連； 首先T載體、表達(dá)載體分別雙酶切： dna 15ul、倆酶各 1ul、buffer 5ul 補(bǔ)水至50，切倆小時(shí)。各切兩管，回收膠（天根的試劑盒）。 圖是膠回收完，跑電泳看看回收效果和濃度。分別是目的片段和倆載體； 連接體系： 載體2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul體系。載體和目的片段比例也嘗試過好幾種，效果都一樣； 轉(zhuǎn)化的感受態(tài)是買的，應(yīng)該不會有什么問題。 最近轉(zhuǎn)化完總是空板，做了4、5次了，有點(diǎn)找不到原因了。希望大神們給點(diǎn)意見。應(yīng)該是連接這部分有問題。 還有幾個(gè)小問題： 回收膠洗脫時(shí)為什么不用EB呢，天根回收膠試劑盒的EB是不是TB緩沖液啊？ 連接不好是不是片段濃度還是有點(diǎn)低呢，比marker亮應(yīng)該大于20ng/ul了，還需要加大酶切體系多回收些嗎？ 有人說takara的solution1 效率不好，是嗎？ IMG_1395.JPG |
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1、建議做雙酶切的時(shí)候降低DNA的量，連接不需要太多，只要確保完全切開； 2、做連接，咱還是別那么省，solution1那是T載體試劑盒里的，做其他連接效率不能保證，建議用takara的T4 DNA連接酶或是其他公司的專用連接酶； 3、“回收膠洗脫時(shí)為什么不用Elution Buffer？”可以用，Elution Buffer一般就是tris-hcl 緩沖液，不過要是用于連接的話，還是建議用蒸餾水溶，因?yàn)閎uffer里的鹽可能會影響后續(xù)的連接步驟。 |
windleakey2樓2014-04-02 21:14:58
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windleakey(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+7, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-04-06 16:28:21
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解答如下： 1 首先檢查引物兩端酶切位點(diǎn)是否設(shè)計(jì)正確，有沒有失誤，盡管從電泳圖來看沒什么問題，但這是解決問題的第一步。 2 其次，酶切雖然切開了，但是由于你酶切時(shí)間過短，你用的那個(gè)公司的內(nèi)切酶效率如何又不知，以我個(gè)人經(jīng)驗(yàn)NEB的內(nèi)切酶雙酶切在4小時(shí)以上，TAKARA和MBI的6小時(shí)以上，從你的電泳圖片來看目的片段切開沒問題，但是載體是否之切開了一個(gè)酶無法鑒定，所以你要延長酶切事件，盡管你這個(gè)實(shí)驗(yàn)這方面的原因很小，但是還是要排除。 3 用Solution I 做連接沒有問題，本人親自測試，效率高過T4連接酶，且適合各種連接方式，不僅僅是TA克隆，有問題的是你的連接條件，最佳連接條件是 4 ℃ 24 h，可保證最大限度的連接反應(yīng)。這個(gè)條件是用于各種連接方式，不僅僅是TA，此外體系最好是10ul，目的片段要多，其和載體濃度比在5:1以上，通常我做起來目的片段的濃度如果是100ng/UL，載體40ng/ul。那么就是目的片段4ul，載體1ul，Solution I 5ul。 4 另外，PET28A作為一種低拷貝質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化過程中的感受態(tài)細(xì)胞要求較高，你是商品化的應(yīng)該沒問題，還有抗性一定要確認(rèn)好，板子沒問題，一些列都排除如果還做不出來，那我也沒法子。 |
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