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windleakey金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒構(gòu)建 連接轉(zhuǎn)化效率低 求幫助啊 已有1人參與
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我實(shí)驗(yàn)是這樣的： 目的基因已經(jīng)連進(jìn)了T載體，下面往表達(dá)載體（pet28a、pGEX-6p-1）里面連； 首先T載體、表達(dá)載體分別雙酶切： dna 15ul、倆酶各 1ul、buffer 5ul 補(bǔ)水至50，切倆小時(shí)。各切兩管，回收膠（天根的試劑盒）。 圖是膠回收完，跑電泳看看回收效果和濃度。分別是目的片段和倆載體； 連接體系： 載體2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul體系。載體和目的片段比例也嘗試過好幾種，效果都一樣； 轉(zhuǎn)化的感受態(tài)是買的，應(yīng)該不會(huì)有什么問題。 最近轉(zhuǎn)化完總是空板，做了4、5次了，有點(diǎn)找不到原因了。希望大神們給點(diǎn)意見。應(yīng)該是連接這部分有問題。 還有幾個(gè)小問題： 回收膠洗脫時(shí)為什么不用EB呢，天根回收膠試劑盒的EB是不是TB緩沖液啊？ 連接不好是不是片段濃度還是有點(diǎn)低呢，比marker亮應(yīng)該大于20ng/ul了，還需要加大酶切體系多回收些嗎？ 有人說takara的solution1 效率不好，是嗎？ IMG_1395.JPG |
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1、建議做雙酶切的時(shí)候降低DNA的量，連接不需要太多，只要確保完全切開； 2、做連接，咱還是別那么省，solution1那是T載體試劑盒里的，做其他連接效率不能保證，建議用takara的T4 DNA連接酶或是其他公司的專用連接酶； 3、“回收膠洗脫時(shí)為什么不用Elution Buffer？”可以用，Elution Buffer一般就是tris-hcl 緩沖液，不過要是用于連接的話，還是建議用蒸餾水溶，因?yàn)閎uffer里的鹽可能會(huì)影響后續(xù)的連接步驟。 |
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windleakey2樓2014-04-02 21:14:58
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