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[求助]
粘性末端連接時長問題 已有5人參與
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小弟最近在做載體構(gòu)建，情況如下： 1）載體pGL3，MluI/BglII兩酶切，大小為4818bp； 2）片段：BssHII/BamHI雙酶切，大小為4923bp; 3）連接摩爾比為：載體/片段=1/4； 4）T4連接10分鐘（25度）。 結(jié)果：挑了六個克隆全為假陽性。 想請教的問題如下： 1）如果連接成功，片段大小近10K，這么大的片段轉(zhuǎn)化（熱激法）是不是有難度？ 2）一般來說熱激法42度多少秒比較合適？ 3）載體和片段都是粘性末端，所以按照說明書操作，T4連接僅用了10分鐘（25度），時間是不是短了？ 4）這個摩爾比是否合適？ 5）挑克隆時按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸餾水中，混勻取1ul做PCR模板，PCR結(jié)果若為陽性，把剩下的9ul用于擴培，不知道這個菌落置于蒸餾水中能存活多長時間？ 目前自己想嘗試以下兩個方法： 1）繼續(xù)挑克隆，說不定能挑到陽性的。 2）16度連接過夜試試。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2014-05-19 08:28:46
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2014-05-19 08:28:46
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1）如果連接成功，片段大小近10K，這么大的片段轉(zhuǎn)化（熱激法）是不是有難度？ 應(yīng)該沒有任何問題。 2）一般來說熱激法42度多少秒比較合適？ 50-90s應(yīng)該都可以，我都試過 3）載體和片段都是粘性末端，所以按照說明書操作，T4連接僅用了10分鐘（25度），時間是不是短了？ 沒鏈接過10分鐘的， 我一般室溫放置一個小時 4）這個摩爾比是否合適？ 記得好像是1:1到1:3之間都可以 5）挑克隆時按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸餾水中，混勻取1ul做PCR模板，PCR結(jié)果若為陽性，把剩下的9ul用于擴培，不知道這個菌落置于蒸餾水中能存活多長時間？ 我一般都是挑個克隆，在一個新板子上劃個線，然后將挑克隆的牙簽或者槍頭放到pcr反應(yīng)里面攪拌一下就可以。 如果你有那么多的假陽性，是否考慮載體酶切不完全，一般粘端沒那么多假陽性的。或者你可以將酶切的載體去磷處理下，基本上不會出現(xiàn)自連情況的 |
2樓2014-05-19 03:03:01
9樓2014-05-23 06:16:10
li569626694
鐵蟲 (初入文壇)
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7樓2014-05-22 14:05:22
gyesang: 屏蔽內(nèi)容, 請認真回答樓主問題，勿灌水！ 2014-05-25 23:00:20
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10樓2014-05-24 00:21:10
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