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sunyu65045木蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
雙酶切的目的基因與質(zhì)粒連接不上怎么辦 已有5人參與
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| 我剛剛開(kāi)始做分子克隆，將雙酶切的基因片段大約1600bp與相同雙酶切的質(zhì)粒進(jìn)行連接，電泳顯示兩個(gè)片段都很亮，酶切反應(yīng)37攝氏度，2小時(shí)。使用T4 連接酶進(jìn)行16攝氏度過(guò)夜連接，設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照（僅含空質(zhì)粒），在含有抗性的平板上進(jìn)行涂布，結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照組長(zhǎng)出很多菌落，而實(shí)驗(yàn)組幾乎不長(zhǎng)菌落，長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行菌落PCR得到的條帶也不是我所期望的，請(qǐng)大家?guī)蛶兔�，看我哪里出現(xiàn)了問(wèn)題。 |
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鬼羽帝魂
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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3樓2014-09-01 16:33:31
2樓2014-09-01 16:28:04
wangranjun
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廣庭之惘然
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4樓2014-09-01 17:17:45
wangtailin
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-09-01 19:21:51
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-09-01 19:21:51
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我剛做的一直連不上，首先查看質(zhì)粒，第二鹽濃度，當(dāng)鹽濃度較高時(shí)就連不上，我就用異丙醇和乙醇沉淀了下，除了下鹽，效果不錯(cuò)，馬上就連上了，我用的是pEASY_Blunt 質(zhì)粒，最好 A260/230>=2.0,我的A260/230=1.8時(shí)陽(yáng)性菌長(zhǎng)了好多，1.5的就那么幾個(gè)，所以建議先去測(cè)一下。。。 |
5樓2014-09-01 18:57:41
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