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梅子清酒木蟲 (初入文壇)
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[求助]
啟動子克隆前的PCR問題 已有1人參與
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用的是高保真酶擴(kuò)增的，目標(biāo)產(chǎn)物大小在1500左右，選用梯度PCR，梯度為50-60度，所選的溫度比引物單上的已經(jīng)小了很多，是去除前端之后重新計(jì)算的退火溫度，但是為什么這樣還是擴(kuò)增不出來？Marker 是用DL5000 擴(kuò)增的體系是（單位：微升）： 5*Primer Star Buffer 5 dNTP Mix 2 Primer 1+1 cDNA 1.5 e 0.25 水 13.75 擴(kuò)增程序： 98 3min 98 10s 50-60 15s 72 2min 72 10min 循環(huán)數(shù)是30 13448-16081.JPG |
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梅子清酒
木蟲 (初入文壇)
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2樓2014-09-02 12:29:23
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+4, 鼓勵回帖交流！ 2014-09-02 15:37:48
梅子清酒: 金幣+2, ★有幫助, 恩！找到原因了，重新反轉(zhuǎn)錄了cDNA，這個東西很奇怪，之前合成的cDNA沒有凍融過，但就是用不了。 2014-09-04 11:42:20
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遇到很難解決的問題的時(shí)候，只能一項(xiàng)一項(xiàng)的分析排除： 1，模板問題，是不是模板存在阻礙PCR的成分； 2，引物問題，是不是引物設(shè)計(jì)不合理； 3，taq酶問題，是不是taq酶對于反應(yīng)程序有特殊的要求； 4，操作問題，是不是有一些操作的細(xì)節(jié)還沒注意。 這4個問題是常見的PCR問題，如果能夠?qū)⒛０?引物/taq/操作都一一確定無誤，那么必定能夠P出來。 希望實(shí)驗(yàn)成功。 |
3樓2014-09-02 13:53:52
梅子清酒
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4樓2014-09-04 11:41:31
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