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[求助]
750bp片段克隆 已有8人參與
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蟲友們大家好！ 我就不賣關(guān)子了。我最近一直在做PCR，目的片段大約是750bp，體系如下：buffer~2ul，dNTPmix~1.6ul ,引物各0.5ul ，模板（cDNA）~2ul，酶~0.2ul，水~13.2ul,一起是20ul的體系， 酶是takara 的ExTaq, 程序：94 5min, 94 30s, annealing 30s, 72 45s, 35個cycles, 72 5min。 剛開始就按引物合成單上面的退火溫度來做，結(jié)果只有100bp的引物二聚體，后來做了個溫度梯度，結(jié)果還只有100bp的引物二聚體。上游引物是參考文獻上面的，下游引物是軟件設(shè)計的，上游引物18bp,下游引物19bp。求高手指導(dǎo)��！先在此謝過大家了！本人金幣不過，忘見諒！ |
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17樓2014-11-19 15:56:46
zhaodahe
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2樓2014-11-18 18:11:54
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-18 22:50:58
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| 如果改變退火溫度和其它條件都無效，也許需要換引物。不過覺得你循環(huán)數(shù)有點多，25到28應(yīng)該就夠了，循環(huán)數(shù)再多，產(chǎn)物也增加不了太多。模板一般加50ng（0.5ul左右）就不少了，你質(zhì)粒什么濃度？你可以把模板質(zhì)粒跑電泳估測濃度，Abs260對過高和過低濃度不準。引物是10uM的吧？別和100uM搞混。還有如果只是一個反應(yīng)的話，可以把反應(yīng)體系增加到50ul，否則蒸發(fā)一點，再掛壁一點，對反應(yīng)體系影響大，而且體積太小不好加樣，另外產(chǎn)物量也增加了。為獲得更多PCR產(chǎn)物，我的經(jīng)驗是增加反應(yīng)體積比過高提高循環(huán)數(shù)好。 |
3樓2014-11-18 18:40:27
4樓2014-11-18 18:41:34
zhaodahe
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5樓2014-11-18 18:44:21
6樓2014-11-18 19:10:47
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8樓2014-11-18 19:27:41
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9樓2014-11-18 20:31:26
10樓2014-11-18 20:40:23
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