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好糾結(jié)新蟲 (初入文壇)
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[求助]
western blot 檢測caspase-3遇到問題，求解答 已有2人參與
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本人通過DNA-ladder,已做出梯度條帶，所以現(xiàn)在欲檢測caspas-3，買的是abcam的caspase-3的多抗，說明書上說的是可以檢測到caspase-3和cleaved caspase-3,但是現(xiàn)在的檢測結(jié)果如圖，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組全部是一個(gè)情況。 western的大致過程如下 1）：用的是12%的膠；2）：半干轉(zhuǎn)膜，15v，30min，；3）：5%脫脂乳封閉（37℃2h,3h,4℃過夜全部試過了）；4）：一抗按照說明書1:1000稀釋，稀釋液是PBS（實(shí)驗(yàn)室一直都是用PBS稀釋，3%的BSA也試過了），時(shí)間事根據(jù)封閉時(shí)間選擇4℃過夜或者37℃2h；5）：洗膜用TBST，10min/次，洗6次；6）：二抗同樣用PBS稀釋，1:5000（內(nèi)參已經(jīng)做出來了，應(yīng)該不是二抗?jié)舛鹊膯栴}）；7）：洗膜同上；8）：顯影，用ECL，根據(jù)說明書暗室3min。照相時(shí)的時(shí)間選擇為5s,200s,50次（試過各種時(shí)間的設(shè)置，都不行）。 增加封閉時(shí)間，加大上樣量都試過了，沒有用。 求高手解答一下困惑，為什么會(huì)出現(xiàn)這種結(jié)果，該怎么辦呀 1.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 我用的是santa cruz 的抗體，有35/20 Kd兩條帶，活化的caspase－3是20kd。一抗?jié)舛仁?：200，二抗?jié)舛扔玫氖?：1000（這個(gè)濃度比平時(shí)別的抗體濃度要高，一般我是用1：2000的），壓片時(shí)間最長有30min的。我覺得cell signalling 的抗體是比較好的，至少我做過的抗體都不錯(cuò)。你說“同樣分子量的其他蛋白都有條帶”，這說明你的前面的步驟是沒有問題的，我覺得可能是你的蛋白里面caspase－3的豐度比較的低，如果你的一抗的來源和二抗的匹配都沒有問題的話，的你可以適當(dāng)?shù)陌岩豢狗跤臅r(shí)間，二抗的濃度，以及ECL曝光的時(shí)間延長一些，我做過的有的蛋白一抗孵育過夜還要ecl過夜才能出來?xiàng)l帶呢。如果能有條帶，哪怕不怎么好，你也可以再改條件。祝你好運(yùn)！ |
2樓2015-01-26 19:48:02
貓薄荷9143
新蟲 (初入文壇)
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3樓2015-01-27 17:08:31
【答案】應(yīng)助回帖
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有三個(gè)建議。 第一，提取蛋白的時(shí)候要注意。加入一些額外蛋白酶抑制劑，例如Roche, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets, USA，一種小藥片，非常好用。蛋白提取后要立即放在-80℃。防止對(duì)蛋白的非特異性降解。 第二，轉(zhuǎn)膜的電壓和時(shí)間要注意一下，可能是轉(zhuǎn)過了頭，丟失了小分子量的蛋白成分，或者是轉(zhuǎn)膜的溫度過高。 第三，可以考慮使用一些陽性對(duì)照，有明顯效應(yīng)的，先把條帶做出來。對(duì)細(xì)胞體系而言，我用過Staurosporine，H2O2，效果都非常明顯。 其他的建議，前面給出的都很好，我就不再多說啦~祝好運(yùn)~ |
4樓2015-02-06 16:22:01
5樓2016-01-24 10:48:52
6樓2016-01-25 08:06:14
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