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好糾結新蟲 (初入文壇)
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[求助]
western blot 檢測caspase-3遇到問題，求解答 已有2人參與
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本人通過DNA-ladder,已做出梯度條帶，所以現在欲檢測caspas-3，買的是abcam的caspase-3的多抗，說明書上說的是可以檢測到caspase-3和cleaved caspase-3,但是現在的檢測結果如圖，實驗組和對照組全部是一個情況。 western的大致過程如下 1）：用的是12%的膠；2）：半干轉膜，15v，30min，；3）：5%脫脂乳封閉（37℃2h,3h,4℃過夜全部試過了）；4）：一抗按照說明書1:1000稀釋，稀釋液是PBS（實驗室一直都是用PBS稀釋，3%的BSA也試過了），時間事根據封閉時間選擇4℃過夜或者37℃2h；5）：洗膜用TBST，10min/次，洗6次；6）：二抗同樣用PBS稀釋，1:5000（內參已經做出來了，應該不是二抗?jié)舛鹊膯栴}）；7）：洗膜同上；8）：顯影，用ECL，根據說明書暗室3min。照相時的時間選擇為5s,200s,50次（試過各種時間的設置，都不行）。 增加封閉時間，加大上樣量都試過了，沒有用。 求高手解答一下困惑，為什么會出現這種結果，該怎么辦呀 1.jpg |
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3樓2015-01-27 17:08:31
飛約瘋人院
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數 +1
| 我用的是santa cruz 的抗體，有35/20 Kd兩條帶，活化的caspase－3是20kd。一抗?jié)舛仁?：200，二抗?jié)舛扔玫氖?：1000（這個濃度比平時別的抗體濃度要高，一般我是用1：2000的），壓片時間最長有30min的。我覺得cell signalling 的抗體是比較好的，至少我做過的抗體都不錯。你說“同樣分子量的其他蛋白都有條帶”，這說明你的前面的步驟是沒有問題的，我覺得可能是你的蛋白里面caspase－3的豐度比較的低，如果你的一抗的來源和二抗的匹配都沒有問題的話，的你可以適當的把一抗孵育的時間，二抗的濃度，以及ECL曝光的時間延長一些，我做過的有的蛋白一抗孵育過夜還要ecl過夜才能出來條帶呢。如果能有條帶，哪怕不怎么好，你也可以再改條件。祝你好運！ |
2樓2015-01-26 19:48:02
4樓2015-02-06 16:22:01
5樓2016-01-24 10:48:52
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