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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 大片段于載體的連接問題
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zy99900810木蟲 (小有名氣)
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[求助]
大片段于載體的連接問題
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本人新手，最近在做片段的連接轉(zhuǎn)化，載體是T載體，自己已經(jīng)往上面連接了一個大約5.5kb的片段，現(xiàn)在還想繼續(xù)連接一個3.5kb的片段，轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)不但3.5kb的片段沒連上，之前的5.5kb片段也消失了即又變成了空載體，質(zhì)粒提取手提與盒子都試過，我用的感受態(tài)是DH5α，有對照，轉(zhuǎn)化過程應該沒有問題，是不是挑取菌落振搖的轉(zhuǎn)數(shù)與溫度有問題，我用的是150轉(zhuǎn)，33度，振搖過夜。另外，如果換用top10感受態(tài)會不會解決這一問題，求大神解答，謝謝！ 補充：連接過程選擇酶切位點均正常切開無甲基化現(xiàn)象，且載體均經(jīng)過CIAP處理。 |
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