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王憶楠yn新蟲 (小有名氣)
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[求助]
pcr反應(yīng)cytb序列擴(kuò)不出原因？求分析！ 已有2人參與
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本人本科生，目前做書虱的種內(nèi)鑒定。之前用引物擴(kuò)增ITS序列，電泳出現(xiàn)條帶，但是送去公司檢測(cè)，說(shuō)亮帶里有比較亂，無(wú)法測(cè)序�，F(xiàn)在用引物擴(kuò)增cytb序列，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有條帶。 試劑 ddh2o 31.5ul dNTP 4ul buffer(Mg2+) 5ul 引物1 1.5ul 4個(gè)ep管分裝 每個(gè)ep12.5ul 引物2 1.5ul taq酶 0.5ul 模板 6ul （之前老師也做過(guò)幾次，同樣沒(méi)有條帶）退火溫度為40.0 41.2 43.9 47.7 52.6 56.5 58.8 60.0“℃。 模板有一年了，但是its 有條帶，很亮，只是無(wú)法測(cè)序。用新的模板可以擴(kuò)出很亮的條帶（cytb）。想求助是不是模板的問(wèn)題. cytb: F TATGTACTACCATGAGGACAAATAT R ATTACACCTCCTAATTATTAGGAAT |
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lomis
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【答案】應(yīng)助回帖
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條帶暗有可能是你引物問(wèn)題，錯(cuò)配率高，由于你用其它模板可以擴(kuò)出目的條帶，證明引物自身沒(méi)有問(wèn)題，只有可能是引物和模板結(jié)合問(wèn)題，或者是模板本身問(wèn)題 1.嘗試再一次降低退火溫度，看是否能擴(kuò)出來(lái) 2.重新設(shè)計(jì)引物，或者增加引物長(zhǎng)度，提高引物特異性 3.認(rèn)真檢測(cè)一下模板，確定模板沒(méi)有問(wèn)題 |
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9樓2015-04-10 22:21:00
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