[交流] PCR相關(guān)問題解答

近期，很多新蟲友問到與PCR相關(guān)的問題，共同點只有一個：P不出來。這個過程很煎熬，從事分子生物學(xué)稍微久一點的蟲子都知道，這都是說起來容易做起來難的工作。基于我多年的經(jīng)驗和教訓(xùn)，大致原因總結(jié)如下：

1. 最可能出現(xiàn)的問題是引物特異性。一般DNA/RNA/質(zhì)粒提取，不會出現(xiàn)太大問題的話，引物特異性是決定PCR成敗的首要因素。所以在設(shè)計引物的時候，一定要謹(jǐn)慎，嚴(yán)格按照引物設(shè)計的原則來進行，尤其是剛剛涉及本領(lǐng)域的蟲友們，還是按照規(guī)矩來比較好。很多蟲友可能是拿到別人設(shè)計的引物來做擴增，這個時候最好是拿到引物設(shè)計的最初資源，或者自己再用Primer去檢測一下，確認(rèn)之后再做擴增，這對你后面的分析會有很大幫助。

2. 反應(yīng)體系的優(yōu)化。反應(yīng)體系對PCR擴增的決定也是至關(guān)重要的，選擇合適的擴增酶和其對應(yīng)的酶buffer是反應(yīng)體系合理的首要因素。不同的實驗?zāi)康膶γ傅倪x擇有針對性，若只是檢測，檢測條帶有無或大小，可用普通的擴增酶即可；若是需要測序，進行后續(xù)實驗，i就要選取高保真酶；一些特殊的目的片段可能需要選取一些特殊的酶來進行擴增。各大擴增酶供應(yīng)現(xiàn)在都比較齊全和成熟，大可與供應(yīng)商聯(lián)系交流，選擇合適自己的酶。其他幾個組分也需要注意，如Mg2+是否有加，dNTP是否有效，模板是否合適。反應(yīng)體系的優(yōu)化是個排除法，做得出來，你一般不會注意。但做不出來，就要一一排除。

3. 反應(yīng)程序的選擇。不同的擴增酶對應(yīng)著不同的反應(yīng)程序，看好protocal再進行程序設(shè)置。這里最需要注意的可能就是退火溫度的選擇，通常來說，退火溫度使用你設(shè)計引物時的溫度，如果不合適，可能就要做梯度，這個過程也比較繁瑣。個人教訓(xùn)是先關(guān)注降低3-5度的結(jié)果，若還沒結(jié)果，可能就要做上下10度的梯度PCR。

4. 凝膠的制備和電泳。很多蟲友上傳一張凝膠電泳圖問原因，這個一般很難解答到底哪個地方出錯了，最可能的就是上述三點的問題。但是凝膠的制備也會影響你最終成像的結(jié)果，凝膠的低濃度，EB的量，凝膠孔的大小，電壓的大小都會影響到你最終圖片的效果。

總之，PCR是個分子生物學(xué)的一個基本技術(shù)。粗略總結(jié)起來，就以上幾點。還是那句話，順利的時候，一次性就出來了；但只有不順利，才會讓你找原因，才會理解和進步。這是個人的教訓(xùn)總結(jié)，希望對大家有用。

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