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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » PCR相關問題解答
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PCR相關問題解答
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近期，很多新蟲友問到與PCR相關的問題，共同點只有一個：P不出來。這個過程很煎熬，從事分子生物學稍微久一點的蟲子都知道，這都是說起來容易做起來難的工作�；谖叶嗄甑慕涷灪徒逃�，大致原因總結如下： 1. 最可能出現的問題是引物特異性。一般DNA/RNA/質粒提取，不會出現太大問題的話，引物特異性是決定PCR成敗的首要因素。所以在設計引物的時候，一定要謹慎，嚴格按照引物設計的原則來進行，尤其是剛剛涉及本領域的蟲友們，還是按照規(guī)矩來比較好。很多蟲友可能是拿到別人設計的引物來做擴增，這個時候最好是拿到引物設計的最初資源，或者自己再用Primer去檢測一下，確認之后再做擴增，這對你后面的分析會有很大幫助。 2. 反應體系的優(yōu)化。反應體系對PCR擴增的決定也是至關重要的，選擇合適的擴增酶和其對應的酶buffer是反應體系合理的首要因素。不同的實驗目的對酶的選擇有針對性，若只是檢測，檢測條帶有無或大小，可用普通的擴增酶即可；若是需要測序，進行后續(xù)實驗，i就要選取高保真酶；一些特殊的目的片段可能需要選取一些特殊的酶來進行擴增。各大擴增酶供應現在都比較齊全和成熟，大可與供應商聯系交流，選擇合適自己的酶。其他幾個組分也需要注意，如Mg2+是否有加，dNTP是否有效，模板是否合適。反應體系的優(yōu)化是個排除法，做得出來，你一般不會注意。但做不出來，就要一一排除。 3. 反應程序的選擇。不同的擴增酶對應著不同的反應程序，看好protocal再進行程序設置。這里最需要注意的可能就是退火溫度的選擇，通常來說，退火溫度使用你設計引物時的溫度，如果不合適，可能就要做梯度，這個過程也比較繁瑣。個人教訓是先關注降低3-5度的結果，若還沒結果，可能就要做上下10度的梯度PCR。 4. 凝膠的制備和電泳。很多蟲友上傳一張凝膠電泳圖問原因，這個一般很難解答到底哪個地方出錯了，最可能的就是上述三點的問題。但是凝膠的制備也會影響你最終成像的結果，凝膠的低濃度，EB的量，凝膠孔的大小，電壓的大小都會影響到你最終圖片的效果。 總之，PCR是個分子生物學的一個基本技術。粗略總結起來，就以上幾點。還是那句話，順利的時候，一次性就出來了；但只有不順利，才會讓你找原因，才會理解和進步。這是個人的教訓總結，希望對大家有用。 |
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