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晞朔

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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[交流] PCR相關(guān)問(wèn)題解答

近期，很多新蟲(chóng)友問(wèn)到與PCR相關(guān)的問(wèn)題，共同點(diǎn)只有一個(gè)：P不出來(lái)。這個(gè)過(guò)程很煎熬，從事分子生物學(xué)稍微久一點(diǎn)的蟲(chóng)子都知道，這都是說(shuō)起來(lái)容易做起來(lái)難的工作。基于我多年的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，大致原因總結(jié)如下：

1. 最可能出現(xiàn)的問(wèn)題是引物特異性。一般DNA/RNA/質(zhì)粒提取，不會(huì)出現(xiàn)太大問(wèn)題的話，引物特異性是決定PCR成敗的首要因素。所以在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，一定要謹(jǐn)慎，嚴(yán)格按照引物設(shè)計(jì)的原則來(lái)進(jìn)行，尤其是剛剛涉及本領(lǐng)域的蟲(chóng)友們，還是按照規(guī)矩來(lái)比較好。很多蟲(chóng)友可能是拿到別人設(shè)計(jì)的引物來(lái)做擴(kuò)增，這個(gè)時(shí)候最好是拿到引物設(shè)計(jì)的最初資源，或者自己再用Primer去檢測(cè)一下，確認(rèn)之后再做擴(kuò)增，這對(duì)你后面的分析會(huì)有很大幫助。

2. 反應(yīng)體系的優(yōu)化。反應(yīng)體系對(duì)PCR擴(kuò)增的決定也是至關(guān)重要的，選擇合適的擴(kuò)增酶和其對(duì)應(yīng)的酶buffer是反應(yīng)體系合理的首要因素。不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)酶的選擇有針對(duì)性，若只是檢測(cè)，檢測(cè)條帶有無(wú)或大小，可用普通的擴(kuò)增酶即可；若是需要測(cè)序，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，i就要選取高保真酶；一些特殊的目的片段可能需要選取一些特殊的酶來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。各大擴(kuò)增酶供應(yīng)現(xiàn)在都比較齊全和成熟，大可與供應(yīng)商聯(lián)系交流，選擇合適自己的酶。其他幾個(gè)組分也需要注意，如Mg2+是否有加，dNTP是否有效，模板是否合適。反應(yīng)體系的優(yōu)化是個(gè)排除法，做得出來(lái)，你一般不會(huì)注意。但做不出來(lái)，就要一一排除。

3. 反應(yīng)程序的選擇。不同的擴(kuò)增酶對(duì)應(yīng)著不同的反應(yīng)程序，看好protocal再進(jìn)行程序設(shè)置。這里最需要注意的可能就是退火溫度的選擇，通常來(lái)說(shuō)，退火溫度使用你設(shè)計(jì)引物時(shí)的溫度，如果不合適，可能就要做梯度，這個(gè)過(guò)程也比較繁瑣。個(gè)人教訓(xùn)是先關(guān)注降低3-5度的結(jié)果，若還沒(méi)結(jié)果，可能就要做上下10度的梯度PCR。

4. 凝膠的制備和電泳。很多蟲(chóng)友上傳一張凝膠電泳圖問(wèn)原因，這個(gè)一般很難解答到底哪個(gè)地方出錯(cuò)了，最可能的就是上述三點(diǎn)的問(wèn)題。但是凝膠的制備也會(huì)影響你最終成像的結(jié)果，凝膠的低濃度，EB的量，凝膠孔的大小，電壓的大小都會(huì)影響到你最終圖片的效果。

總之，PCR是個(gè)分子生物學(xué)的一個(gè)基本技術(shù)。粗略總結(jié)起來(lái)，就以上幾點(diǎn)。還是那句話，順利的時(shí)候，一次性就出來(lái)了；但只有不順利，才會(huì)讓你找原因，才會(huì)理解和進(jìn)步。這是個(gè)人的教訓(xùn)總結(jié)，希望對(duì)大家有用。

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1樓 2015-05-16 11:04:28

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yingheqian

金蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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晞朔(金幣+1): 謝謝參與

樓主不錯(cuò)，分享很好

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回復(fù)此樓

3樓2015-05-16 13:27:00

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

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匿名

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晞朔(金幣+1): 謝謝參與

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2樓2015-05-16 11:17:56

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feng890327

新蟲(chóng) (初入文壇)

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

其實(shí)就是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)累積的過(guò)程

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回復(fù)此樓

9樓2015-05-22 13:47:37

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TNX6

銀蟲(chóng) (小有名氣)

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

剛開(kāi)始學(xué)做這個(gè)，謝樓主！蟲(chóng)胞們，祝福我吧。。。

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回復(fù)此樓

11樓2015-06-03 17:09:38

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