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corner_g新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
PCR測(cè)序后產(chǎn)生的SNP是否是基因的真實(shí)存在的SNP？ 已有2人參與
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各位大神好 背景： 1. 正在擴(kuò)增一個(gè)基因，有文獻(xiàn)顯示該基因在其他物種中為單一拷貝。 2. 正在研究的這個(gè)物種相關(guān)研究背景不多，材料的倍型目前不容易確定（但是可以確定所有材料）。 問(wèn)題： 目前該基因的cDNA序列已經(jīng)通過(guò)RACE拿到，基因組序列也通過(guò)根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)的引物分別拿到全長(zhǎng)并完成了拼接，并且在兩端做了步移，也都得到了結(jié)果（在基因組序列拼接和步移的時(shí)候都有較長(zhǎng)的overlap）。 但是根據(jù)結(jié)果來(lái)看cDNA序列與基因組序列之間SNP較多，基因組每次擴(kuò)增結(jié)果建克隆測(cè)序克隆之間的SNP也比較多（約0.5~2%），使用的酶是takara的LA taq，目前由于無(wú)法確定這些SNP中哪些是PCR出的錯(cuò)誤，哪些是測(cè)序的錯(cuò)誤（峰圖都還可以），哪些是真正的SNP。 5端步移結(jié)果顯示出有兩套不同的上游調(diào)控序列，但是都跟RACE結(jié)果不同（RACE結(jié)果只到ATG上游大概70bp左右，已經(jīng)去掉RACE隨機(jī)引物序列）。 所以請(qǐng)問(wèn)，如何確定這些SNP是不是基因不同拷貝造成的？如何知道拷貝數(shù)并且知道相關(guān)基因序列呢？ 希望有經(jīng)驗(yàn)的大蝦不吝賜教。謝謝。 |
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corner_g
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luwei13566
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-05-28 08:31:27
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-05-28 08:31:27
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LZ你現(xiàn)在目的基因的cDNA和DNA全長(zhǎng)序列都已經(jīng)得到測(cè)序了，而且你無(wú)論是擴(kuò)cDNA還是DNA所用的酶都是LA Taq？ 盡管其他文獻(xiàn)里說(shuō)該基因在其他物種是單拷貝，但是你還是得證明該基因是否是多拷貝，排除這個(gè)因素后基本可以定性是PCR的問(wèn)題了。 1.多拷貝可用northern blot驗(yàn)證。 2.你用的這個(gè)酶我用過(guò)，說(shuō)實(shí)話保真度并不高，如果你克隆的基因還比較長(zhǎng)，而且擴(kuò)增循環(huán)數(shù)過(guò)多的話可能性更大。 如果你的SNP在序列中間比較多，個(gè)人認(rèn)為是PCR保真度不高所導(dǎo)致的，特別是你說(shuō)克隆之間的測(cè)序結(jié)果都不一樣，這說(shuō)明你的PCR后期的循環(huán)已經(jīng)出現(xiàn)了不少的突變，才導(dǎo)致后期涂板長(zhǎng)出的單克隆測(cè)序結(jié)果都不一樣，建議優(yōu)化一下PCR的條件，或者選取高保真酶擴(kuò)增之后再加A做TA克隆。 |
3樓2015-05-26 22:12:27
4樓2015-05-27 12:47:39
corner_g
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嗯，謝謝回復(fù)。 cDNA用的是試劑盒的SeqAmp，理論上來(lái)說(shuō)肯定是保真的，但是RACE做的不是很理想，條帶不是很好，所以轉(zhuǎn)化效率很低，3端5端都是只有一兩個(gè)克隆的，所以不能完全認(rèn)為cDNA序列是對(duì)的。 酶的問(wèn)題我也覺(jué)得比較對(duì)，已經(jīng)著手訂購(gòu)高保真酶了。 至于多拷貝驗(yàn)證，倍性不清楚的情況下用norhtern可以檢測(cè)么？或者您說(shuō)的是southern？想過(guò)這些手段，主要覺(jué)得第一是沒(méi)合適的內(nèi)參。第二是也不能確定材料的倍性，就放棄了。 |
5樓2015-05-28 07:43:33
corner_g
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6樓2015-05-28 07:44:42
7樓2015-05-28 10:27:30
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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嗯，更正一下，你這種情況確認(rèn)拷貝得用southern。 1.至于內(nèi)參，因?yàn)槟愕倪@個(gè)材料總基因組序列沒(méi)有測(cè)，內(nèi)參確實(shí)不好找，你說(shuō)有文獻(xiàn)顯示該基因在其他物種中為單一拷貝，多看看別人確認(rèn)單拷貝是怎么做的，他們用的內(nèi)參你說(shuō)不定你就可以用。 2.如果你做race出來(lái)的轉(zhuǎn)化子只有幾個(gè)，這幾個(gè)轉(zhuǎn)化子都測(cè)序了嗎，之間是否有差異？ |
8樓2015-05-28 11:42:11
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