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嗎子金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒一直連接不上，求助。。。。 已有7人參與
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我最近構(gòu)建一個質(zhì)粒，將目的基因片段（250bp）,連接到表達(dá)載體上（1 5000 bp）。但是連接后涂扳一直沒上出想要的菌落來。方法如下： 先將目的基因連接于T載體，然后同時用kpn 1 和 sac 1 雙酶切 T載體 和表達(dá)載體，并凝膠電泳回收目的片段及雙酶切后的表達(dá)載體，然后進(jìn)行重組連接。 連接用的TAKARA T4酶 10ul體系。1ul 酶，1ul buffer,其余加載體和片段，試了很多比例（載體：片段=1:1,3:1,10:1,20:1 1:10 都沒有成功），連接16℃過夜12-14h。 涂扳后16小時內(nèi)基本不長什么菌落，或者長的話也很小根本不好挑，長大了挑做PCR要么陰性要么假陽性。做了快2個月了，一直不知道問題出在哪啊，都要崩潰了。特在此求助各位蟲友啦。謝謝啦 附上我膠回收的2張圖片，請大家?guī)兔Ψ治鲆幌掳。粍俑屑ぁ?img src="https://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/smile.gif" align="absmiddle" border="0"> 左邊為雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒，右邊是目的片段.jpg 膠回收后的電泳.jpg |
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嗎子
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