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嗎子金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒一直連接不上，求助。。。。 已有7人參與
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我最近構(gòu)建一個質(zhì)粒，將目的基因片段（250bp）,連接到表達(dá)載體上（1 5000 bp）。但是連接后涂扳一直沒上出想要的菌落來。方法如下： 先將目的基因連接于T載體，然后同時用kpn 1 和 sac 1 雙酶切 T載體 和表達(dá)載體，并凝膠電泳回收目的片段及雙酶切后的表達(dá)載體，然后進(jìn)行重組連接。 連接用的TAKARA T4酶 10ul體系。1ul 酶，1ul buffer,其余加載體和片段，試了很多比例（載體：片段=1:1,3:1,10:1,20:1 1:10 都沒有成功），連接16℃過夜12-14h。 涂扳后16小時內(nèi)基本不長什么菌落，或者長的話也很小根本不好挑，長大了挑做PCR要么陰性要么假陽性。做了快2個月了，一直不知道問題出在哪啊，都要崩潰了。特在此求助各位蟲友啦。謝謝啦 附上我膠回收的2張圖片，請大家?guī)兔Ψ治鲆幌掳�，不勝感激�?img src="https://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/smile.gif" align="absmiddle" border="0"> 左邊為雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒，右邊是目的片段.jpg 膠回收后的電泳.jpg |
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嗎子: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝，我現(xiàn)在連接10ul，然后是把10ul，加入50ul感受態(tài)轉(zhuǎn)化，16℃過夜；載體雙酶切后跑電泳回收的，跑的時候還作了2個單酶切的對照和1個沒有切的質(zhì)粒，然后2個單酶切都切開了，雙切的條帶也和單切的一樣變長了。轉(zhuǎn)化應(yīng)該是沒有問題。換了酶實驗還是沒連上，我覺得應(yīng)該是載體那出了問題。 2015-09-11 10:57:06
嗎子: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝，我現(xiàn)在連接10ul，然后是把10ul，加入50ul感受態(tài)轉(zhuǎn)化，16℃過夜；載體雙酶切后跑電泳回收的，跑的時候還作了2個單酶切的對照和1個沒有切的質(zhì)粒，然后2個單酶切都切開了，雙切的條帶也和單切的一樣變長了。轉(zhuǎn)化應(yīng)該是沒有問題。換了酶實驗還是沒連上，我覺得應(yīng)該是載體那出了問題。 2015-09-11 10:57:06
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我建議你先將連接產(chǎn)物跑電泳，看看有沒有連上。 如果連上了說明是轉(zhuǎn)化的問題。一般50ul的感受態(tài)細(xì)胞加入2~5ul的連接產(chǎn)物，這樣不會改變感受態(tài)細(xì)胞的生存環(huán)境，如果連接產(chǎn)物用多了的話也有可能不長菌落。 如果沒有連接上的話，很可能是因為你的15000bp載體并沒有切干凈，所以連接效果不好。建議你重新酶切 |
7樓2015-09-11 10:30:06
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10樓2015-09-11 11:22:56
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