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嗎子金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒一直連接不上，求助。。。。 已有7人參與
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我最近構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒，將目的基因片段（250bp）,連接到表達(dá)載體上（1 5000 bp）。但是連接后涂扳一直沒(méi)上出想要的菌落來(lái)。方法如下： 先將目的基因連接于T載體，然后同時(shí)用kpn 1 和 sac 1 雙酶切 T載體 和表達(dá)載體，并凝膠電泳回收目的片段及雙酶切后的表達(dá)載體，然后進(jìn)行重組連接。 連接用的TAKARA T4酶 10ul體系。1ul 酶，1ul buffer,其余加載體和片段，試了很多比例（載體：片段=1:1,3:1,10:1,20:1 1:10 都沒(méi)有成功），連接16℃過(guò)夜12-14h。 涂扳后16小時(shí)內(nèi)基本不長(zhǎng)什么菌落，或者長(zhǎng)的話也很小根本不好挑，長(zhǎng)大了挑做PCR要么陰性要么假陽(yáng)性。做了快2個(gè)月了，一直不知道問(wèn)題出在哪啊，都要崩潰了。特在此求助各位蟲(chóng)友啦。謝謝啦 附上我膠回收的2張圖片，請(qǐng)大家?guī)兔Ψ治鲆幌掳�，不勝感激�?img src="https://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/smile.gif" align="absmiddle" border="0"> 左邊為雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒，右邊是目的片段.jpg 膠回收后的電泳.jpg |
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嗎子
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8樓2015-09-11 10:59:23
evangelina
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
嗎子: 金幣+20, ★★★很有幫助, 感謝你第一個(gè)解答我的問(wèn)題 2015-08-26 12:18:24
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嗎子: 金幣+20, ★★★很有幫助, 感謝你第一個(gè)解答我的問(wèn)題 2015-08-26 12:18:24
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問(wèn)題應(yīng)該出在T4酶或者你的盤(pán)子 建議你做一個(gè)T4酶的陽(yáng)性對(duì)照，例如用T4酶連接blunt end切的質(zhì)粒，看能不能長(zhǎng) 我的經(jīng)驗(yàn)是一般很小的菌落都不是真的，可能你用的抗生素不對(duì)或者濃度太高 有時(shí)候insert如果帶有毒性也不好克隆，可以試試換個(gè)菌株 例如 JM109 祝你成功！ |
2樓2015-08-26 11:35:01
嗎子
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3樓2015-08-26 12:17:08
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4樓2015-08-26 20:31:41
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