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嗎子金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒一直連接不上，求助。。。。 已有7人參與
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我最近構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒，將目的基因片段（250bp）,連接到表達(dá)載體上（1 5000 bp）。但是連接后涂扳一直沒(méi)上出想要的菌落來(lái)。方法如下： 先將目的基因連接于T載體，然后同時(shí)用kpn 1 和 sac 1 雙酶切 T載體 和表達(dá)載體，并凝膠電泳回收目的片段及雙酶切后的表達(dá)載體，然后進(jìn)行重組連接。 連接用的TAKARA T4酶 10ul體系。1ul 酶，1ul buffer,其余加載體和片段，試了很多比例（載體：片段=1:1,3:1,10:1,20:1 1:10 都沒(méi)有成功），連接16℃過(guò)夜12-14h。 涂扳后16小時(shí)內(nèi)基本不長(zhǎng)什么菌落，或者長(zhǎng)的話也很小根本不好挑，長(zhǎng)大了挑做PCR要么陰性要么假陽(yáng)性。做了快2個(gè)月了，一直不知道問(wèn)題出在哪啊，都要崩潰了。特在此求助各位蟲(chóng)友啦。謝謝啦 附上我膠回收的2張圖片，請(qǐng)大家?guī)兔Ψ治鲆幌掳�，不勝感激�?img src="https://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/smile.gif" align="absmiddle" border="0"> 左邊為雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒，右邊是目的片段.jpg 膠回收后的電泳.jpg |
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xbshyy
新蟲(chóng) (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
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嗎子: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝，我現(xiàn)在連接10ul，然后是把10ul，加入50ul感受態(tài)轉(zhuǎn)化，16℃過(guò)夜；載體雙酶切后跑電泳回收的，跑的時(shí)候還作了2個(gè)單酶切的對(duì)照和1個(gè)沒(méi)有切的質(zhì)粒，然后2個(gè)單酶切都切開(kāi)了，雙切的條帶也和單切的一樣變長(zhǎng)了。轉(zhuǎn)化應(yīng)該是沒(méi)有問(wèn)題。換了酶實(shí)驗(yàn)還是沒(méi)連上，我覺(jué)得應(yīng)該是載體那出了問(wèn)題。 2015-09-11 10:57:06
嗎子: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝，我現(xiàn)在連接10ul，然后是把10ul，加入50ul感受態(tài)轉(zhuǎn)化，16℃過(guò)夜；載體雙酶切后跑電泳回收的，跑的時(shí)候還作了2個(gè)單酶切的對(duì)照和1個(gè)沒(méi)有切的質(zhì)粒，然后2個(gè)單酶切都切開(kāi)了，雙切的條帶也和單切的一樣變長(zhǎng)了。轉(zhuǎn)化應(yīng)該是沒(méi)有問(wèn)題。換了酶實(shí)驗(yàn)還是沒(méi)連上，我覺(jué)得應(yīng)該是載體那出了問(wèn)題。 2015-09-11 10:57:06
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我建議你先將連接產(chǎn)物跑電泳，看看有沒(méi)有連上。 如果連上了說(shuō)明是轉(zhuǎn)化的問(wèn)題。一般50ul的感受態(tài)細(xì)胞加入2~5ul的連接產(chǎn)物，這樣不會(huì)改變感受態(tài)細(xì)胞的生存環(huán)境，如果連接產(chǎn)物用多了的話也有可能不長(zhǎng)菌落。 如果沒(méi)有連接上的話，很可能是因?yàn)槟愕?5000bp載體并沒(méi)有切干凈，所以連接效果不好。建議你重新酶切 |
7樓2015-09-11 10:30:06
evangelina
無(wú)蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
嗎子: 金幣+20, ★★★很有幫助, 感謝你第一個(gè)解答我的問(wèn)題 2015-08-26 12:18:24
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
嗎子: 金幣+20, ★★★很有幫助, 感謝你第一個(gè)解答我的問(wèn)題 2015-08-26 12:18:24
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問(wèn)題應(yīng)該出在T4酶或者你的盤(pán)子 建議你做一個(gè)T4酶的陽(yáng)性對(duì)照，例如用T4酶連接blunt end切的質(zhì)粒，看能不能長(zhǎng) 我的經(jīng)驗(yàn)是一般很小的菌落都不是真的，可能你用的抗生素不對(duì)或者濃度太高 有時(shí)候insert如果帶有毒性也不好克隆，可以試試換個(gè)菌株 例如 JM109 祝你成功！ |
2樓2015-08-26 11:35:01
嗎子
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3樓2015-08-26 12:17:08
huangxun2000
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4樓2015-08-26 20:31:41
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