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[交流]
載體、目的基因雙酶切、連接問題 已有17人參與
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各位大俠，幫我分析下PET-28a載體上用BamH I、Sal I酶切能切開嗎？，序列見圖。兩個位點相差13bp，還有我在目的基因上設計酶切引物，引物前方只加了三個保護性堿基，這樣子行不？我連接了好久了都沒連接上。我用的酶是TAKARA的，按照公司推薦的載體切2-3小時，800多bp的目的切2小時。兩個酶buffer不一樣，有10xT的公用buffer，反應溫度也不一樣，BamH I30℃，Sal I37℃，按照takara推薦的公用buffer以及37℃酶切，直接雙酶切以及分步酶切都試過了，挑取的陽性克隆，提質(zhì)粒后與原始載體大小接近，目的基因未連接成功 ，有沒有什么方法能夠證明雙酶切切開了？1.png |
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14樓2016-08-04 10:15:50
原海亮
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空載載體的處理確實容易出現(xiàn)這樣情況，可以將回收后的載體重復二次酶切試試，保證酶切完全。或者可以找實驗室心里構(gòu)建好的pET+目的片段的載體，那它作為出發(fā)載體進行雙酶切（當然這個載體上保留著你需要的雙酶切位點），這樣你回收載體時候，就可以同過看有沒有目的條帶切出來，來判斷載體的酶切情況。第二，片段的處理，首先確定所選的酶為在目的片段里不存在，然后酶切處理同樣要求盡可能的酶切完全，很多人為了避免后面出現(xiàn)類似麻煩的事情，可以把pcr產(chǎn)物連接T載體，一方面可以送測序驗證是否正確后，再安排接下來實驗。另一方面，這樣做你酶切目的片段時候，就可以通過回收從T載體上切下來的片段進行連接轉(zhuǎn)化，祝好！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-03-23 12:18:32
2樓2016-03-23 11:26:48
4樓2016-03-24 21:44:23
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不好檢測，可以把膠的濃度提高 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-03-24 22:25:35
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總瓊脂糖凝膠電泳檢測。一個原質(zhì)粒做對照，一個雙酶切，兩個單酶切。成像規(guī)律，最下邊是原質(zhì)粒對照，其次是雙酶切，最上邊是兩條單酶切的帶。有細微差別。參考。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-03-26 20:46:20
7樓2016-03-26 20:56:17
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8樓2016-03-28 17:38:58
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很簡單啊，你設置一組對照就知道有木有切開啊 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
9樓2016-03-31 12:18:06
想學好的學渣
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用他們公司的快切酶，最好不要用sal I那個酶。三個保護堿基夠了。你要保證你插入的片段不會造成移碼突變。另外載體和片段配比也要保證好。推薦全式金的原核表達的載體，用著還可以 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
10樓2016-03-31 14:39:11
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