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載體、目的基因雙酶切、連接問(wèn)題 已有17人參與
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各位大俠，幫我分析下PET-28a載體上用BamH I、Sal I酶切能切開(kāi)嗎？，序列見(jiàn)圖。兩個(gè)位點(diǎn)相差13bp，還有我在目的基因上設(shè)計(jì)酶切引物，引物前方只加了三個(gè)保護(hù)性堿基，這樣子行不？我連接了好久了都沒(méi)連接上。我用的酶是TAKARA的，按照公司推薦的載體切2-3小時(shí)，800多bp的目的切2小時(shí)。兩個(gè)酶buffer不一樣，有10xT的公用buffer，反應(yīng)溫度也不一樣，BamH I30℃，Sal I37℃，按照takara推薦的公用buffer以及37℃酶切，直接雙酶切以及分步酶切都試過(guò)了，挑取的陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒后與原始載體大小接近，目的基因未連接成功 ，有沒(méi)有什么方法能夠證明雙酶切切開(kāi)了？1.png |
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xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-08-04 06:48:14
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xn8008: 金幣+1, 歡迎發(fā)帖交流 2016-08-04 06:48:14
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用他們公司的快切酶，最好不要用sal I那個(gè)酶。三個(gè)保護(hù)堿基夠了。你要保證你插入的片段不會(huì)造成移碼突變。另外載體和片段配比也要保證好。推薦全式金的原核表達(dá)的載體，用著還可以 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
10樓2016-03-31 14:39:11
2樓2016-03-23 11:26:48
原海亮
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空載載體的處理確實(shí)容易出現(xiàn)這樣情況，可以將回收后的載體重復(fù)二次酶切試試，保證酶切完全�；蛘呖梢哉覍�(shí)驗(yàn)室心里構(gòu)建好的pET+目的片段的載體，那它作為出發(fā)載體進(jìn)行雙酶切（當(dāng)然這個(gè)載體上保留著你需要的雙酶切位點(diǎn)），這樣你回收載體時(shí)候，就可以同過(guò)看有沒(méi)有目的條帶切出來(lái)，來(lái)判斷載體的酶切情況。第二，片段的處理，首先確定所選的酶為在目的片段里不存在，然后酶切處理同樣要求盡可能的酶切完全，很多人為了避免后面出現(xiàn)類(lèi)似麻煩的事情，可以把pcr產(chǎn)物連接T載體，一方面可以送測(cè)序驗(yàn)證是否正確后，再安排接下來(lái)實(shí)驗(yàn)。另一方面，這樣做你酶切目的片段時(shí)候，就可以通過(guò)回收從T載體上切下來(lái)的片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，祝好！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
3樓2016-03-23 12:18:32
Bearxionghui
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4樓2016-03-24 21:44:23
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