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[求助]
DNA含量多少才能在瓊脂糖凝膠上顯示出亮帶
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想問(wèn)下各位大蝦，DNA要上多少量才能在瓊脂糖上顯示出亮帶啊。看marker中最亮的750bp的dna50ng就很亮了，可是我的總dna用核酸測(cè)定儀測(cè)出來(lái)是110ng/ul，傷了5ul有550ng怎么跑電泳都沒(méi)見(jiàn)到亮帶呢，想問(wèn)下有哪些因素會(huì)影響亮帶的顯現(xiàn)，另外做過(guò)的一般上了多少含量的dna呢，希望各位有經(jīng)驗(yàn)的大蝦指點(diǎn)啊，感激不盡 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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laozuzunzhe: 金幣+1, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-11-27 16:45:54
scelab: 金幣+6, xxjl 2012-11-29 14:03:23
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scelab: 金幣+6, xxjl 2012-11-29 14:03:23
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1、核酸檢測(cè)儀既可以檢測(cè)DNA也可以檢測(cè)RNA，不知道樓主的DNA有沒(méi)有用RNA酶消化吶？ 2、一般電泳時(shí)，還會(huì)加loading dye 并且用量比較隨意（嚴(yán)格來(lái)看，似乎要求DNA 5 ul：1 ul loading dye），所以電泳跑膠只能大概估計(jì)濃度，不知道樓主有么有考慮這點(diǎn)？ 3、我們這邊用得3K的marker，1、3、5k為亮條帶，貌似認(rèn)為是10ng/ul的量（這個(gè)一時(shí)也記不太清），所以應(yīng)該不用太高的濃度就可以看見(jiàn)的，樓主還是看看電泳以前的步驟有么有問(wèn)題吧  |
2樓2012-11-26 20:49:59
cicelyzh
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3樓2012-11-27 07:23:41
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用了rna酶的，上次rna酶用的不夠，所以跑出來(lái)在100bp下面有拖帶，后面改進(jìn)了多加了些，拖帶不見(jiàn)了，但是板上什么也沒(méi)有，整個(gè)膠上有彌漫一點(diǎn)一點(diǎn)的小亮點(diǎn)，不知道是怎么回事，拍了照，但是由于像素不高，亮點(diǎn)在照片上顯示不出來(lái)，我沒(méi)加樣的涌到也出現(xiàn)一些小亮點(diǎn)，不知道是不是緩沖液用久了的原因，但marker是跑出來(lái)了，樣本dna是總細(xì)菌，應(yīng)該大于2000bp，我有加loadingbuffer的，就是感覺(jué)核酸測(cè)定儀測(cè)了有這么高的dna含量，可就不知道為什么跑不出來(lái)，我擴(kuò)增一次也看不到亮帶，第二輪擴(kuò)增才看到亮帶 |
4樓2012-11-27 15:19:44
5樓2012-11-27 15:21:42
czdaeq
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6樓2012-11-27 16:36:03
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7樓2012-11-28 08:05:41
kiruwa
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rainwander: 金幣+1, 鼓勵(lì)分享經(jīng)驗(yàn) 2012-11-28 16:04:27
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| 你是用nano drop監(jiān)測(cè)DNA濃度的嗎？ 現(xiàn)在我們實(shí)驗(yàn)室和其他的一些實(shí)驗(yàn)室（都在美國(guó)）已經(jīng)再也不用nano drop等靠紫外光定量的DNA濃度測(cè)定儀器了。 蛋白質(zhì)，腐植酸和其他的一些雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致nanodrop給出虛假結(jié)果。 |
8樓2012-11-28 08:49:37
kiruwa
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9樓2012-11-28 08:50:37
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scelab: 金幣+6, 謝謝交流 2012-11-28 10:28:23
scelab: 金幣+6, 謝謝交流 2012-11-28 10:28:23
| 看了你前面的帖子，發(fā)現(xiàn)你們似乎用的是更加老式的機(jī)器，那結(jié)果就更不可信了。Nanodrop有時(shí)會(huì)給出特別漂亮的260/280比值，但是一個(gè)教授說(shuō)樣品中含有大量蛋白質(zhì)？？也會(huì)給出這樣的比值（原話不太記得了，如果有誤請(qǐng)諒解）。他們現(xiàn)在跑膠定量（有專門(mén)定量分析軟件）。我們實(shí)驗(yàn)室一般用pico green定量。 另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)室也已經(jīng)放棄 nanodrop了。 |
10樓2012-11-28 08:55:35
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