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yesxing2011

新蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
金幣: 9
帖子: 1
在線: 15分鐘
蟲號(hào): 1809190
注冊: 2012-05-10
專業(yè): 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

[求助] 質(zhì)粒構(gòu)建的問題

大家好，在此求助個(gè)問題，感謝回答：
《質(zhì)粒構(gòu)建》
引物退火形成insert后，測shRNA濃度

酶切3h，回收后，測dsDNA濃度

連接16°c，3h （質(zhì)粒與insert濃度比為1:5）

轉(zhuǎn)化：

1、實(shí)驗(yàn)組：連接產(chǎn)物10ul加到100ul感受態(tài)細(xì)胞中

2、對(duì)照組a：酶切后，不加insert，同樣加入ligation進(jìn)行連接

對(duì)照組b：感受態(tài)細(xì)胞不加連接產(chǎn)物，其他條件一樣，進(jìn)行轉(zhuǎn)化

對(duì)照組c：酶切后，不加insert，也不加ligation

結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組均長出2-8個(gè)菌落

對(duì)照組a 長出15個(gè)菌落

對(duì)照組b 不長

對(duì)照組c 長出3個(gè)菌落

問題：

奇怪的是，同樣的雙酶切后載體，為什么沒加insert的平板長出的菌落比加了insert的長得還要多？？難道還有連接上又有不表達(dá)的？？？這個(gè)怎么解釋呢？

insert進(jìn)行Lipo2000轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示有干擾效果，是否可說明insert制備沒問題？

對(duì)照組a與實(shí)驗(yàn)組長出菌落數(shù)量接近，是否可以得出酶切不成功，長出的都是假陽性呢？

Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ相差6bp，可以用瓊脂糖電泳能鑒別出來嗎？有什么方法可以在轉(zhuǎn)化前就確定質(zhì)粒酶切成功呢？

感謝前輩的支持
此致
敬禮

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1樓 2013-01-06 08:15:55

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

cicelyzh

鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)

MolEPI: 10
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專業(yè): 生物化學(xué)

【答案】應(yīng)助回帖

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沒加insert的載體有自連，并且比實(shí)驗(yàn)組還多，說明載體酶切不完全。實(shí)際上任何酶切反應(yīng)都有完成程度問題，不會(huì)是100%。對(duì)照C比A菌落少是因?yàn)榧恿薼igase之后，線性載體換化，轉(zhuǎn)化效率提高。加入insert后，在連接酶的作用下，可能有一端連上了insert, 而另外一端不匹配，所以insert干擾載體的自連。
相差6bp瓊脂糖電泳是不能看出來的。判斷酶切是否成功可以在做雙酶切的同時(shí)分別做兩個(gè)單酶切的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。然后跑電泳檢測。質(zhì)粒被單酶切開后從超螺旋結(jié)構(gòu)變成線性，很容易從膠上判斷。
你的實(shí)驗(yàn)組沒有多少克隆，可以做菌落PCR篩一下。不過我個(gè)人認(rèn)為你的菌落數(shù)很少，比對(duì)照組a還少，是陽性克隆的概率不大。

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