版塊導(dǎo)航: 正在加載中...

應(yīng)《網(wǎng)絡(luò)安全法》要求，自2017年10月1日起，未進(jìn)行實(shí)名認(rèn)證將不得使用互聯(lián)網(wǎng)跟帖服務(wù)。為保障您的帳號(hào)能夠正常使用，請(qǐng)盡快對(duì)帳號(hào)進(jìn)行手機(jī)號(hào)驗(yàn)證，感謝您的理解與支持！

24小時(shí)熱門版塊排行榜

北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

返回列表

yesxing2011

新蟲 (初入文壇)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
金幣: 9
帖子: 1
在線: 15分鐘
蟲號(hào): 1809190
注冊(cè): 2012-05-10
專業(yè): 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

[求助] 質(zhì)粒構(gòu)建的問(wèn)題

大家好，在此求助個(gè)問(wèn)題，感謝回答：
《質(zhì)粒構(gòu)建》
引物退火形成insert后，測(cè)shRNA濃度

酶切3h，回收后，測(cè)dsDNA濃度

連接16°c，3h （質(zhì)粒與insert濃度比為1:5）

轉(zhuǎn)化：

1、實(shí)驗(yàn)組：連接產(chǎn)物10ul加到100ul感受態(tài)細(xì)胞中

2、對(duì)照組a：酶切后，不加insert，同樣加入ligation進(jìn)行連接

對(duì)照組b：感受態(tài)細(xì)胞不加連接產(chǎn)物，其他條件一樣，進(jìn)行轉(zhuǎn)化

對(duì)照組c：酶切后，不加insert，也不加ligation

結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組均長(zhǎng)出2-8個(gè)菌落

對(duì)照組a 長(zhǎng)出15個(gè)菌落

對(duì)照組b 不長(zhǎng)

對(duì)照組c 長(zhǎng)出3個(gè)菌落

問(wèn)題：

奇怪的是，同樣的雙酶切后載體，為什么沒(méi)加insert的平板長(zhǎng)出的菌落比加了insert的長(zhǎng)得還要多？？難道還有連接上又有不表達(dá)的？？？這個(gè)怎么解釋呢？

insert進(jìn)行Lipo2000轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示有干擾效果，是否可說(shuō)明insert制備沒(méi)問(wèn)題？

對(duì)照組a與實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)出菌落數(shù)量接近，是否可以得出酶切不成功，長(zhǎng)出的都是假陽(yáng)性呢？

Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ相差6bp，可以用瓊脂糖電泳能鑒別出來(lái)嗎？有什么方法可以在轉(zhuǎn)化前就確定質(zhì)粒酶切成功呢？

感謝前輩的支持
此致
敬禮

回復(fù)此樓

» 猜你喜歡

不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千” 已經(jīng)有0人回復(fù)
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)? 已經(jīng)有146人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI” 已經(jīng)有0人回復(fù)
納米粒度分析已經(jīng)有3人回復(fù)
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京已經(jīng)有0人回復(fù)
留學(xué)--博士招生已經(jīng)有16人回復(fù)
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限已經(jīng)有4人回復(fù)
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑已經(jīng)有0人回復(fù)
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦已經(jīng)有3人回復(fù)

» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:

求助質(zhì)粒的構(gòu)建問(wèn)題已經(jīng)有9人回復(fù)
我構(gòu)建質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證的問(wèn)題已經(jīng)有13人回復(fù)
質(zhì)粒構(gòu)建疑難雜癥已經(jīng)有22人回復(fù)
質(zhì)粒構(gòu)建已經(jīng)有13人回復(fù)
關(guān)于農(nóng)桿菌單菌株/雙質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建問(wèn)題已經(jīng)有14人回復(fù)
串聯(lián)表達(dá)的問(wèn)題已經(jīng)有13人回復(fù)
構(gòu)建好的質(zhì)粒如何防止丟失已經(jīng)有12人回復(fù)
轉(zhuǎn)質(zhì)粒不成功,好幾次了,大家給分析一下問(wèn)題會(huì)出在哪里已經(jīng)有11人回復(fù)
關(guān)于SiRNA表達(dá)載體構(gòu)建的問(wèn)題已經(jīng)有9人回復(fù)
求助：用pXMJ19構(gòu)建的重組質(zhì)粒在谷氨酸棒桿菌不表達(dá)，應(yīng)該如何解決？已經(jīng)有6人回復(fù)
求助��！轉(zhuǎn)質(zhì)粒出現(xiàn)問(wèn)題了！已經(jīng)有13人回復(fù)
重組質(zhì)粒構(gòu)建疑難問(wèn)題已經(jīng)有3人回復(fù)
【求助/交流】構(gòu)建質(zhì)粒問(wèn)題已經(jīng)有8人回復(fù)
【求助/交流】大腸桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，出來(lái)的不是我要的了，怎么回事？已經(jīng)有13人回復(fù)
【求助/交流】請(qǐng)教質(zhì)粒構(gòu)建問(wèn)題已經(jīng)有9人回復(fù)
【求助/交流】關(guān)于質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)的問(wèn)題已經(jīng)有14人回復(fù)
【求助/交流】在構(gòu)建基因表達(dá)載體的時(shí)候什么時(shí)候需要人為地在上面加上啟動(dòng)子？已經(jīng)有6人回復(fù)

1樓 2013-01-06 08:15:55

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

cicelyzh

鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)

MolEPI: 10
應(yīng)助: 1662 (講師)
金幣: 8693.8
紅花: 72
帖子: 3516
在線: 456小時(shí)
蟲號(hào): 1614001
注冊(cè): 2012-02-13
專業(yè): 生物化學(xué)

【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

沒(méi)加insert的載體有自連，并且比實(shí)驗(yàn)組還多，說(shuō)明載體酶切不完全。實(shí)際上任何酶切反應(yīng)都有完成程度問(wèn)題，不會(huì)是100%。對(duì)照C比A菌落少是因?yàn)榧恿薼igase之后，線性載體換化，轉(zhuǎn)化效率提高。加入insert后，在連接酶的作用下，可能有一端連上了insert, 而另外一端不匹配，所以insert干擾載體的自連。
相差6bp瓊脂糖電泳是不能看出來(lái)的。判斷酶切是否成功可以在做雙酶切的同時(shí)分別做兩個(gè)單酶切的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。然后跑電泳檢測(cè)。質(zhì)粒被單酶切開后從超螺旋結(jié)構(gòu)變成線性，很容易從膠上判斷。
你的實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有多少克隆，可以做菌落PCR篩一下。不過(guò)我個(gè)人認(rèn)為你的菌落數(shù)很少，比對(duì)照組a還少，是陽(yáng)性克隆的概率不大。

贊一下