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yesxing2011新蟲 (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒構(gòu)建的問題
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大家好，在此求助個問題，感謝回答： 《質(zhì)粒構(gòu)建》 引物退火形成insert后，測shRNA濃度 酶切3h，回收后，測dsDNA濃度 連接16°c，3h （質(zhì)粒與insert濃度比為1:5） 轉(zhuǎn)化： 1、實驗組：連接產(chǎn)物10ul加到100ul感受態(tài)細胞中 2、對照組a：酶切后，不加insert，同樣加入ligation進行連接 對照組b：感受態(tài)細胞不加連接產(chǎn)物，其他條件一樣，進行轉(zhuǎn)化 對照組c：酶切后，不加insert，也不加ligation 結(jié)果：實驗組均長出2-8個菌落 對照組a 長出15個菌落 對照組b 不長 對照組c 長出3個菌落 問題： 奇怪的是，同樣的雙酶切后載體，為什么沒加insert的平板長出的菌落比加了insert的長得還要多？？難道還有連接上又有不表達的？？？這個怎么解釋呢？ insert進行Lipo2000轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示有干擾效果，是否可說明insert制備沒問題？ 對照組a與實驗組長出菌落數(shù)量接近，是否可以得出酶切不成功，長出的都是假陽性呢？ Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ相差6bp，可以用瓊脂糖電泳能鑒別出來嗎？有什么方法可以在轉(zhuǎn)化前就確定質(zhì)粒酶切成功呢？ 感謝前輩的支持 此致 敬禮 |
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cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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沒加insert的載體有自連，并且比實驗組還多，說明載體酶切不完全。實際上任何酶切反應(yīng)都有完成程度問題，不會是100%。對照C比A菌落少是因為加了ligase之后，線性載體換化，轉(zhuǎn)化效率提高。加入insert后，在連接酶的作用下，可能有一端連上了insert, 而另外一端不匹配，所以insert干擾載體的自連。 相差6bp瓊脂糖電泳是不能看出來的。判斷酶切是否成功可以在做雙酶切的同時分別做兩個單酶切的對照實驗。然后跑電泳檢測。質(zhì)粒被單酶切開后從超螺旋結(jié)構(gòu)變成線性，很容易從膠上判斷。 你的實驗組沒有多少克隆，可以做菌落PCR篩一下。不過我個人認為你的菌落數(shù)很少，比對照組a還少，是陽性克隆的概率不大。 |
2樓2013-01-06 09:18:49
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