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半生一夢(mèng)木蟲 (小有名氣)
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[求助]
原核表達(dá)跑膠檢測(cè)不到產(chǎn)物
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本人從去年11月份斷斷續(xù)續(xù)做原核表達(dá)至今 一直都沒有成功表達(dá) 目的基因連接的是pet-28a載體 受體細(xì)胞選擇bl21(de3) 載體和大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室的師姐都用來做過表達(dá) 是ok的 表達(dá)載體在轉(zhuǎn)到bl21(de3)之前也送去測(cè)序過 沒有問題 誘導(dǎo)條件也嘗試過37度3h和20度18h兩種 iptg濃度從0.1mM到1mM也做過優(yōu)化 來來回回page膠跑了也有十幾二十塊了 自己做的膠沒有跑出來 拜托師姐做的膠也沒跑出來 所以一直很糾結(jié)啊 求高人指點(diǎn)！ |
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cicelyzh
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重測(cè)質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化，多挑幾個(gè)菌落進(jìn)行表達(dá)吧。 菌株的話，找一些小公司買一個(gè)感受態(tài)幾百元錢，也很快。 當(dāng)然后手，最好還是換個(gè)載體掛上trx啊，NusA啊等大標(biāo)簽表達(dá)一下試一試了。買個(gè)載體，酶切位點(diǎn)都能找到一樣的，轉(zhuǎn)換一下應(yīng)該還是不難的。畢竟就算28表達(dá)出來的話，產(chǎn)量不高，還有可能有可溶性問題，到時(shí)候還得換著試 |
7樓2013-05-29 08:54:21
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【答案】應(yīng)助回帖
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半生一夢(mèng): 金幣+2, ★有幫助 2013-05-31 21:02:16
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| 如果實(shí)驗(yàn)室只有一個(gè)菌株，那說明你們做蛋白表達(dá)不是強(qiáng)項(xiàng)，所以有表達(dá)不出來的很正常。我做原核表達(dá)常有表達(dá)不出來的。我覺得做原核表達(dá)最重要的就是篩載體和菌株，至于其它的條件，雖然很重要，但是我覺得不如載體和菌株的作用更具決定性。我見過一個(gè)實(shí)驗(yàn)室做原核表達(dá)，目的片段上入門載體后，直接gateway重組到幾十個(gè)表達(dá)載體上全試一遍。 |
10樓2013-05-30 16:02:33
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