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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 畢赤酵母電轉(zhuǎn)
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畢赤酵母電轉(zhuǎn)
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做了很久畢赤酵母GS115的電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)的是DNA片段，雙交換敲除基因。 轉(zhuǎn)化方法用的是Wu S, Letchworth G J. High efficiency transformation by electroporation of pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol[J]. Biotechniques, 2004, 36(1): 152-155 1. 50mlYPD搖菌至OD 1.5~2.0 2. 收集菌體。每10ml作一管收集，即為一個感受態(tài) 3. 每管以8 mL LDST（ 100 mM LiAc, 10 mM DTT,0.6 M sorbitol, and 10 mM Tris-HCl, pH 7.5）室溫處理30min 4. 4℃離心。以1ml預冷的1M 山梨醇洗三次 5. 最后以80微升預冷的1M 山梨醇重懸。感受態(tài)濃度約為10^10個細胞/mL 電轉(zhuǎn)條件1500V，25μF，200Ω（這個條件的電轉(zhuǎn)儀要去別的實驗室借用，本實驗有的電轉(zhuǎn)儀是1500V，36μF,186Ω，兩種條件都用過）。2mm電擊杯。 DNA量10~100ng，溶于5~10μL水中�；旌虾蟊�5min。（電轉(zhuǎn)儀預熱，電擊杯預冷）。電擊后迅速加入1ml 預冷的1M 山梨醇。30℃孵育1.5h。然后加入1mlYPD，150rpm搖2~3h。取200μL涂板（YPD含1M山梨醇，300μg/ml G418） 每次結果都是長3~4天無明顯克隆。5~6天時長滿背景克�。ㄓ刑舫鲵炞C過，都是假陽性）。陰性對照基本不長的。前后做了幾十次了。就得到2個陽性克隆。有很多時候，能長出幾個克隆。重新劃線于G418平板上，仍然可以長，但是提基因組PCR驗證都不對。 做的都快吐了  求蟲友們給點意見！[ Last edited by 皇馬鐵衛(wèi) on 2013-7-3 at 15:45 ] |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 | 蛋白表達純化鑒定精華 |
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9樓2013-07-06 15:36:24
lwiaanngg
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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1. 你這個問題比較復雜，從描述上看，你的ligation做的如何呢？如果你的ligation效果不好，即使你的電轉(zhuǎn)效率再高，你拿到都是背景克隆。如果你的plasmid是transfer vector，可以考慮先用e.coli做完ligation，等提出很好的positive plasmid后再轉(zhuǎn)入酵母中。 2. 個人建議你做competent cell時用瓶子而不是管子，呵呵 |
3樓2013-07-04 17:10:43
ericyo918
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4樓2013-07-04 17:44:48
5樓2013-07-05 10:10:03
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