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淺笑包包新蟲 (小有名氣)
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[求助]
熒光定量PCR
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| 熒光定量PCR的引物可以用來做一般的PCR嗎？最近要做熒光定量，設(shè)計(jì)了熒光定量的引物，先提取RNA, 然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,就用熒光定量的引物來做一般的PCR,擴(kuò)增一個(gè)基因，還做了一個(gè)不加模板的陰性對(duì)照，跑膠后發(fā)現(xiàn)對(duì)照與實(shí)驗(yàn)組的條帶一樣，可能是發(fā)生了引物二聚體的現(xiàn)象，是引物出問題了嗎?不能用熒光定量的引物做一般的PCR,但是我導(dǎo)師說可以，求證？？、 |
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2樓2013-09-16 13:55:50
淺笑包包
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3樓2013-09-16 16:56:03
4樓2013-09-17 19:16:28
hl16010921
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【答案】應(yīng)助回帖
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淺笑包包: 金幣+5, ★★★很有幫助, 三克油~受教啦~~ 2013-09-18 07:48:38
淺笑包包: 金幣+5, ★★★很有幫助, 三克油~受教啦~~ 2013-09-18 07:48:38
| 1.可以。擴(kuò)增條件可以和定量相同。實(shí)際上有時(shí)為了省熒光染料，在摸realtimePCR條件時(shí)我們常常用realtime的引物用普通PCR摸條件。2.一般熒光定量引物的二聚體是最少的。因?yàn)閞ealtimePCR要嚴(yán)格控制二聚體。3.陰性對(duì)照出結(jié)果，可能是出現(xiàn)了污染。二聚體和目的條帶從電泳上一般能分辨出來。二聚體都低于100bp，亮度大，有彌散。realtimePCR的目的序列一般都設(shè)計(jì)成100~150bp，最長(zhǎng)不超過300bp。不建議設(shè)計(jì)100bp以下的片段，太難和引物二聚體區(qū)分了。4.普通PCR的目的是什么？得到目的片段然后進(jìn)行克隆，realtime的引物是不行的，片段太短，有時(shí)甚至不是開放閱讀框，沒有酶切位點(diǎn)，沒調(diào)節(jié)閱讀框無法正確表達(dá)。補(bǔ)充半定量的電泳結(jié)果是可以的，可以選realtimePCR對(duì)數(shù)期最大的循環(huán)做普通PCR，電泳，軟件分析圖像。 |
5樓2013-09-17 19:37:39
淺笑包包
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6樓2013-09-18 07:48:17
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7樓2013-09-18 08:17:06
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