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反轉(zhuǎn)錄的cDNA沒問題，但是實(shí)時定量PCR卻不行。內(nèi)參擴(kuò)不出來啊。 已有4人參與
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反轉(zhuǎn)錄RNA，用得到的cDNA做了實(shí)時定量。cDNA的濃度結(jié)果都可以，260/280約為1.8，260/230約為2.2~2.38，濃度為1300~1500ng/ul.測濃度時的峰值也正常，只有260nm處有峰。但是，問題是，有的cDNA能正常擴(kuò)增出內(nèi)參基因，有的擴(kuò)不出來。補(bǔ)充一下，內(nèi)參沒問題。這是什么原因��？怎么解決��？前輩們，請教。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] [ Last edited by 再見螢火蟲89 on 2013-12-26 at 14:46 ] |
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2樓2013-12-26 14:47:54
gyesang
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再見螢火蟲89: 金幣+5, ★有幫助 2013-12-26 15:43:12
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再見螢火蟲89: 金幣+5, ★有幫助 2013-12-26 15:43:12
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"cDNA的濃度結(jié)果都可以，260/280約為1.8~1.9，260/230約為2.2~2.3，濃度為1300~1500ng/ul.測濃度時的峰值也正常，只有260nm處有峰。" 一般是不測定cDNA濃度的，即使你測出值來也是不準(zhǔn)確的，沒有參考意義 cDNA的好壞取決于你做逆轉(zhuǎn)錄時的模板的質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄的過程，一般我們控制RNA的質(zhì)量，判定RNA的濃度，純度和完整度后不同樣本取同量RNA做逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后再去等量cDNA去做realtime 現(xiàn)在你的問題是，有的cDNA能正常擴(kuò)增出內(nèi)參基因，有的擴(kuò)不出來，我覺得可能還是你的擴(kuò)不出來的那些樣品的RNA提取的有問題，你可以check一下RNA，后再做判斷 |
3樓2013-12-26 14:50:24
4樓2013-12-26 15:43:00
cicelyzh
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