hailey

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[求助] 2.3kb 大片段pcr 求賜教已有4人參與

請(qǐng)路過的蟲友大神們看看，我的片段是2.3kb的，GC 含量是59.61%  ，所以就沒用GC buffer 。
所用PCR體系25ul  ,
10*transtart buffer 2.5ul
transtart Taq  ase 0.5ul
dNTPs  1ul
primer1  1ul
primer 1ul
cDNA 2ul
dd 水  17ul

95度 5min
94度 30s
51度 -61度  設(shè)置梯度各30s
72度 2.5min
72度 10min
35個(gè)循環(huán)

沒有P出來(lái)目的條帶，什么都沒有，本想上傳圖片的，網(wǎng)絡(luò)不好沒有上傳成功

求賜教

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時(shí)刻為夢(mèng)想而戰(zhàn)��！

1樓 2014-06-02 00:19:02

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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-06-04 19:56:51

我之前也擴(kuò)增2kd左右片段，退火溫度55度，90s，也可適當(dāng)?shù)奶岣邷囟戎?8度，90s，25或30個(gè)循環(huán)，別的條件和你基本一致，擴(kuò)增出目的條帶。如果條件許可，你可以換聚合酶，phusion甚至是Q5。

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hailey

12樓2014-06-03 15:47:44

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1.拿內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增下看看你的cDNA質(zhì)量咋樣~
2.如果雜帶太多那就是你的PCR條件不適合或者你設(shè)計(jì)的引物不好。

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7樓2014-06-02 21:36:31

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BioChen

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-06-02 10:49:45

換cDNA模板。

2.3k不大，cDNA模板質(zhì)粒不高通常是P不出來(lái)的原因。另外，cDNA是有組織特異性的，你的基因確定在這個(gè)組織或細(xì)胞系中有比較高的表達(dá)？

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2樓2014-06-02 07:34:15

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2樓: Originally posted by BioChen at 2014-06-02 07:34:15
換cDNA模板。

嗯嗯。。。是有高表達(dá)的，可以查到相關(guān)文獻(xiàn)的，今天準(zhǔn)備加10* GC enhanger 試試..

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3樓2014-06-02 09:12:30

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BioChen

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3樓: Originally posted by hailey at 2014-06-02 09:12:30
嗯嗯。。。是有高表達(dá)的，可以查到相關(guān)文獻(xiàn)的，今天準(zhǔn)備加10* GC enhanger 試試.....

之前的回答，打錯(cuò)字了，囧
是cDNA質(zhì)量不高

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4樓2014-06-02 09:19:40

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4樓: Originally posted by BioChen at 2014-06-02 09:19:40
之前的回答，打錯(cuò)字了，囧
是cDNA質(zhì)量不高...

還是沒有目的條帶，有較明顯的條帶，但不是我想要的，雜帶還是多。。。

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5樓2014-06-02 15:15:05

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引用回帖:

5樓: Originally posted by hailey at 2014-06-02 15:15:05
還是沒有目的條帶，有較明顯的條帶，但不是我想要的，雜帶還是多。。。...

學(xué)會(huì)自己分析原因。
1、若目的條帶完全沒有，換模板，換引物，換酶等等
2、若目的條帶很弱，切膠回收，多做幾管PCR，應(yīng)該能滿足量的要求。還有就是優(yōu)化PCR條件以增加目的條帶，減弱雜帶。

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6樓2014-06-02 17:31:40

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5樓: Originally posted by hailey at 2014-06-02 15:15:05
還是沒有目的條帶，有較明顯的條帶，但不是我想要的，雜帶還是多。。。...

提高退火溫度

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借口很賤，，，

8樓2014-06-02 22:46:33

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退火溫度已經(jīng)提高到 71度了，還是沒有目的條帶… 我自己都被搞無(wú)語(yǔ)啦…

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9樓2014-06-02 22:58:20

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hailey: 金幣+5, ★有幫助 2014-06-03 19:04:13

引用回帖:

9樓: Originally posted by hailey at 2014-06-02 22:58:20
退火溫度已經(jīng)提高到 71度了，還是沒有目的條帶… 我自己都被搞無(wú)語(yǔ)啦…

我暈，你都快趕上延伸溫度了這能行？？你的引物這么高溫度可能都不和模板結(jié)合

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10樓2014-06-03 02:12:09

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