 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 2006 | 回復(fù): 16 | ||||
Ever希夷新蟲(chóng) (初入文壇)
|
[求助]
請(qǐng)問(wèn)大片段怎么擴(kuò) 已有9人參與
|
|||
| 構(gòu)建好了質(zhì)粒，但是目的片段將近8000bp，這種大片段用LA taq酶一直擴(kuò)不出來(lái)，請(qǐng)問(wèn)怎么辦？ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | Vectors contribution |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有101人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 質(zhì)粒PCR產(chǎn)物片段大小問(wèn)題
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 如何確定自己的目的片段 PCR 痛苦中
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 關(guān)于設(shè)計(jì)克隆引物時(shí)產(chǎn)物片段大小有限制嗎，如果我沒(méi)有全長(zhǎng)要怎么做能克隆到它的全長(zhǎng)
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 緊！急！如何確定目的片段的長(zhǎng)度
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 大片段PCR擴(kuò)增求助
已經(jīng)有23人回復(fù)
- PCR大片段問(wèn)題
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 如何擴(kuò)增GC含量較高的片段
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 求長(zhǎng)片段（7.5 kb）PCR擴(kuò)增方法？
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 我要擴(kuò)3kb的片段，人的GLDC基因，總是擴(kuò)不出來(lái)，求大俠指點(diǎn)呀
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 短片段PCR擴(kuò)增
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 5kb大片段PCR擴(kuò)增求助
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 大片段DNA測(cè)序的問(wèn)題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 怎么計(jì)算DNA片段的大小是多少bp?
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 大片段PCR(2.1K)擴(kuò)增求助
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 大片段連接問(wèn)題
已經(jīng)有20人回復(fù)
- PCR時(shí)出現(xiàn)了非目的片段的超大片段條帶
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 反轉(zhuǎn)錄之后PCR擴(kuò)增片段問(wèn)題的請(qǐng)教，急急急
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 大片段PCR擴(kuò)增求助
已經(jīng)有34人回復(fù)
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 5--6KB的基因片段多長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增？用什么樣的酶好呢？
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 長(zhǎng)片段DNA如何連接載體
已經(jīng)有21人回復(fù)
- RT-PCR 試驗(yàn)中擴(kuò)增片段大�。�
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】菌落PCR擴(kuò)出來(lái)的片段不是目的片段，咋辦啊？？？？
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】PCR擴(kuò)增核心片段，再也擴(kuò)不出來(lái)了，怎么辦
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 【求助/交流】pfu擴(kuò)出的片段回收后怎么加A
已經(jīng)有12人回復(fù)
凌波麗
專(zhuān)家顧問(wèn) (知名作家)
-
專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn): +218 - MolEPI: 44
- 應(yīng)助: 397 (碩士)
- 貴賓: 0.044
- 金幣: 2118.9
- 散金: 10
- 紅花: 208
- 帖子: 5633
- 在線: 571.6小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1766465
- 注冊(cè): 2012-04-19
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學(xué)綜合
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門(mén)吹雪170: 金幣+5, 應(yīng)助指數(shù)+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-08 09:00:17
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門(mén)吹雪170: 金幣+5, 應(yīng)助指數(shù)+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-08 09:00:17
|
長(zhǎng)片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無(wú)糾錯(cuò)功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯(cuò)功能）的混合物，以Taq酶為主。 2.當(dāng)需要擴(kuò)增的片段大于20kd時(shí)，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴(kuò)增反應(yīng)的溫度降低2-3度。樓主的擴(kuò)增片段還到不了2020kd,甜茶堿可以少加點(diǎn)。 3.適當(dāng)升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。 4.變性時(shí)間要短，尤其是一般不超過(guò)30 s，尤其是模板長(zhǎng)度超過(guò)8KD時(shí)更是如此，變性時(shí)間長(zhǎng)會(huì)破壞模板。 5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時(shí)加長(zhǎng)延伸反應(yīng)時(shí)間，長(zhǎng)度為3-5kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為5-10分鐘，長(zhǎng)度為20-35kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為20分鐘，樓主的PCR的延伸反應(yīng)時(shí)間可能為12-16分鐘左右。 6.模板濃度最好在1ng/L以內(nèi)。 7.應(yīng)用長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液。10X長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的PCR引物（25-30 bp) |
3樓2014-07-08 01:51:15
Neo2000
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 639 (博士)
- 金幣: 8720.2
- 紅花: 37
- 帖子: 1700
- 在線: 269.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 322365
- 注冊(cè): 2007-03-11
- 專(zhuān)業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
2樓2014-07-07 19:25:34
凌波麗
專(zhuān)家顧問(wèn) (知名作家)
-
專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn): +218 - MolEPI: 44
- 應(yīng)助: 397 (碩士)
- 貴賓: 0.044
- 金幣: 2118.9
- 散金: 10
- 紅花: 208
- 帖子: 5633
- 在線: 571.6小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1766465
- 注冊(cè): 2012-04-19
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學(xué)綜合
4樓2014-07-08 02:05:25
syx1983
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 7 (幼兒園)
- 金幣: 1691.5
- 散金: 138
- 紅花: 2
- 帖子: 334
- 在線: 679.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 693147
- 注冊(cè): 2009-01-15
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 高分子組裝與超分子結(jié)構(gòu)
5樓2014-07-08 21:39:25
6樓2014-07-08 22:08:24
jinpeng_6118
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 28 (小學(xué)生)
- 金幣: 5027
- 散金: 25
- 紅花: 2
- 帖子: 856
- 在線: 147.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1019189
- 注冊(cè): 2010-05-15
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 微生物遺傳學(xué)
7樓2014-07-08 22:17:56
游俠892
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 49 (小學(xué)生)
- 金幣: 8246.4
- 散金: 76
- 紅花: 6
- 帖子: 2102
- 在線: 138.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 490693
- 注冊(cè): 2008-01-03
- 專(zhuān)業(yè): 作物種質(zhì)資源與遺傳育種學(xué)
8樓2014-07-08 22:52:56
jamesfeng
鐵蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 46.5
- 帖子: 13
- 在線: 5.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 3314281
- 注冊(cè): 2014-07-08
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
★ ★ ★ ★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門(mén)吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-09 09:31:15
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門(mén)吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-09 09:31:15
| 不管怎么樣，先根據(jù)GC content stucture 先把引物設(shè)計(jì)好，設(shè)計(jì)引物是最為關(guān)鍵的，現(xiàn)在世面上買(mǎi)的酶純度都很高，加上配套的buffer mix 或者buffer 鎂離子，效率都很高，建議分成2kb左右的小片段，錯(cuò)配率會(huì)降低很多，最后再將片段整合在一起，這樣堿基的缺失率就會(huì)降低，后續(xù)的定點(diǎn)突變也沒(méi)那么麻煩 |
9樓2014-07-08 23:58:11
PCR-CL
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 13 (小學(xué)生)
- 金幣: 171
- 帖子: 39
- 在線: 19小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2224095
- 注冊(cè): 2013-01-05
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
10樓2014-07-09 10:44:53
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 Ever希夷 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +5 | 87639 2026-03-21 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料學(xué)學(xué)碩080502 337求調(diào)劑-一志愿華中科技大學(xué) +4 | 順順順mr 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 機(jī)械專(zhuān)碩299求調(diào)劑至材料 +3 | kkcoco25 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +10 | yy要上岸呀 2026-03-17 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 睿08 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 二本跨考鄭大材料306英一數(shù)二 +3 | z1z2z3879 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿中國(guó)石油大學(xué)（華東） 本科齊魯工業(yè)大學(xué) +3 | 石能偉 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +9 | 梁梁校校 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿 西北大學(xué) ，070300化學(xué)學(xué)碩，總分287，雙非一本，求調(diào)劑。 +3 | 晨昏線與星海 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿西南交大，求調(diào)劑 +5 | 材化逐夢(mèng)人 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)0703化學(xué)318分，有科研經(jīng)歷，求調(diào)劑 +4 | 一瓶苯甲酸 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿吉林大學(xué)材料學(xué)碩321求調(diào)劑 +11 | Ymlll 2026-03-18 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 085410人工智能專(zhuān)碩317求調(diào)劑（0854都可以） +4 | xbxudjdn 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研]
 320求調(diào)劑0856
+3
|
不想起名字112 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +10 | llllkkkhh 2026-03-18 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +3 | 志存高遠(yuǎn)意在機(jī)?/a> 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +11 | zjl的號(hào) 2026-03-16 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 材料專(zhuān)碩326求調(diào)劑 +6 | 墨煜姒莘 2026-03-15 | 7/350 |
|
|
|
[考研]
11408 一志愿西電，277分求調(diào)劑
+3
|
zhouzhen654 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 中科院材料273求調(diào)劑 +4 | yzydy 2026-03-15 | 4/200 |
|