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Ever希夷新蟲 (初入文壇)
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[求助]
請問大片段怎么擴 已有9人參與
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| 構(gòu)建好了質(zhì)粒，但是目的片段將近8000bp，這種大片段用LA taq酶一直擴不出來，請問怎么辦？ |
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 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 | Vectors contribution |
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【答案】應(yīng)助回帖
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+5, 應(yīng)助指數(shù)+1, 鼓勵回帖交流 2014-07-08 09:00:17
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長片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無糾錯功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯功能）的混合物，以Taq酶為主。 2.當(dāng)需要擴增的片段大于20kd時，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴增反應(yīng)的溫度降低2-3度。樓主的擴增片段還到不了2020kd,甜茶堿可以少加點。 3.適當(dāng)升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。 4.變性時間要短，尤其是一般不超過30 s，尤其是模板長度超過8KD時更是如此，變性時間長會破壞模板。 5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時加長延伸反應(yīng)時間，長度為3-5kd的模板延伸反應(yīng)時間為5-10分鐘，長度為20-35kd的模板延伸反應(yīng)時間為20分鐘，樓主的PCR的延伸反應(yīng)時間可能為12-16分鐘左右。 6.模板濃度最好在1ng/L以內(nèi)。 7.應(yīng)用長片段PCR緩沖溶液。10X長片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.設(shè)計較長的PCR引物（25-30 bp) |
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