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Hzhenping新蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助Western Blot實(shí)驗(yàn)條帶沒出現(xiàn)的原因分析及解決辦法 已有4人參與
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去年下半年做了一段時(shí)間WB實(shí)驗(yàn)，前田再次做，只換了個(gè)一抗和細(xì)胞裂解液，其他都沒變（當(dāng)然目的蛋白也不同了）。去年能出條帶，這次卻不能了。。。 現(xiàn)將改變的試劑及可疑操作羅列如下，供大神分析并搭救  1.細(xì)胞裂解液：RAPI細(xì)胞裂解液（強(qiáng)），碧云天生物技術(shù)研究所； 2.一抗:Isotype, IgG; Host, Rabbit; Species Reactivity, Human, Rat。 二抗：Goat Anti-Rabbit IgG. 3.目的蛋白大小約21KD，內(nèi)參用GAPDH，于27KD-18KD處剪膜。一抗用5%BSA1:1500稀釋，37oC孵育90min；二抗用5%BSA1:3000稀釋,37oC孵育90min。 4.DAB顯色試劑盒顯色。PVDF膜的熊樣如下：A 今天做了點(diǎn)蛋白試驗(yàn)（有叫“點(diǎn)雜交”），膜泡甲醇，晾干；蛋白樣品（4個(gè)）按20ug/10ul加2xLoading Buffer煮沸后點(diǎn)于膜上,干后封閉，孵一抗，二抗，顯色。PVDF膜熊樣如下：B、C。（白斑之間即為蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)，由于膜被封閉液和5%BSA浸透而呈現(xiàn)這樣） A.jpg B.jpg C.jpg |
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Hzhenping2樓2014-07-10 07:48:19
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4樓2014-07-11 11:26:57
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一、Western Blot實(shí)驗(yàn)條帶沒出現(xiàn)的原因分析及解決辦法 ： 原因分析 解決辦法 1.一抗和二抗失效 1. 更換抗體；選擇現(xiàn)用現(xiàn)配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更換為同種同屬的同亞型的抗體底物 3.發(fā)光液失效 3. 更換新的發(fā)光液 4.抗體染色不充分 4. 增加抗體濃度；延長孵育時(shí)間 5.被測樣品中不含有目的蛋白質(zhì)或者目的 蛋白質(zhì)含量太低 5. 設(shè)置陽性對照。確定標(biāo)本中是否含有目的蛋白質(zhì)； 增加樣品 的上樣量。 6. 溶液中有辣根過氧化物酶的抑制劑 6.用透析和超濾除去所用溶液中如疊氮化鈉之類的抑制劑 7.抗體活力降低 7.在抗體活力保存時(shí)間內(nèi)使用抗體；工作液現(xiàn)用現(xiàn)配 二、WB出現(xiàn)白斑是因?yàn)檗D(zhuǎn)膜過程有氣泡存在；或者抗體的分布不均勻，孵育抗體時(shí)要使用搖床。 三、剪好的PVDF膜在使用前需要甲醇里泡1-2min，在零度的轉(zhuǎn)膜液中孵育3-5min。 意見僅供參考。 |
6樓2014-07-11 23:54:30
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7樓2014-07-12 00:02:37
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8樓2014-07-12 06:57:26
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